【摘要】：目的探究癲癇持續(xù)狀態(tài)(Status epilepticus,SE)后血腦屏障(Blood-brain barrier,BBB)通透性變化的時(shí)間模式以及髓過(guò)氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)對(duì)BBB和自發(fā)性復(fù)發(fā)性癲癇(Spontaneous recurrent seizures,SRS)的影響。方法第一部分:選取雄性C57BL/6小鼠50只,隨機(jī)分為癲癇組(n=45)和假誘導(dǎo)組(n=5),其中癲癇組經(jīng)腹腔注射匹羅卡品誘導(dǎo)SE后,根據(jù)觀察時(shí)間節(jié)點(diǎn)的不同分為:0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和30 d六組;假誘導(dǎo)組腹腔注射同等劑量的生理鹽水作為對(duì)照。采用水合氯醛麻醉后摘眼球取血法收集血清標(biāo)本;采用心臟灌注后斷頭取腦法收集腦組織標(biāo)本;采用酶聯(lián)免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)血清中S100β蛋白含量;采用免疫組化法檢測(cè)腦組織中白蛋白的含量。血清中S100β蛋白含量和腦組織中白蛋白含量用于評(píng)估BBB的通透性,根據(jù)小鼠SE后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)蛋白含量的變化探究BBB通透性變化的時(shí)間模式。第二部分:選取雄性C57BL/6小鼠40只,隨機(jī)分為4-氨基苯甲酰肼(4-aminobenzoic hydrazide,ABAH)組(n=15)、生理鹽水組(n=15)和假誘導(dǎo)組(n=10)。ABAH組小鼠腹腔注射匹羅卡品誘導(dǎo)SE后2小時(shí)腹腔注射MPO特異性抑制劑ABAH(40mg/kg),以后2次/日給藥;生理鹽水組在誘導(dǎo)SE后2小時(shí)腹腔注射同等劑量的生理鹽水;假誘導(dǎo)組未使用匹羅卡品誘導(dǎo)SE的發(fā)生,余處理同生理鹽水組。成功誘導(dǎo)SE 24小時(shí)后,選取誘導(dǎo)成功的生理鹽水組、ABAH組和假誘導(dǎo)組小鼠各五只,采用水合氯醛麻醉后摘眼球取血法收集血清標(biāo)本;采用心臟灌注后斷頭取腦法收集腦組織標(biāo)本;采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清中S100β蛋白含量;采用免疫組化法檢測(cè)腦組織中白蛋白的含量,評(píng)估ABAH對(duì)BBB通透性的影響。選取誘導(dǎo)成功的生理鹽水組、ABAH組和假誘導(dǎo)組小鼠各五只,每日給藥前1小時(shí)觀察并記錄小鼠癲癇首次發(fā)作的時(shí)間、每日發(fā)作的頻率,評(píng)估MPO對(duì)癲癇復(fù)發(fā)的影響。結(jié)果1.小鼠在腹腔注射匹羅卡品4.5±2.2min后即出現(xiàn)面部無(wú)意識(shí)運(yùn)動(dòng)、尾部僵硬、冷汗淋漓以及全身震顫等癲癇1-2級(jí)發(fā)作;20.4±8.2min后出現(xiàn)癲癇3級(jí)及以上發(fā)作,如雙側(cè)前肢的肌陣攣、后肢站立以及姿勢(shì)失控、跳躍、跌倒等表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)用于誘導(dǎo)SE的小鼠共計(jì)75只,其中25只小鼠抽搐劇烈死亡,成功誘導(dǎo)SE小鼠50只,誘導(dǎo)成功率為66.7%。假誘導(dǎo)組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)任何癲癇樣發(fā)作。2.SE后,在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)測(cè)定小鼠血清中S100β蛋白含量發(fā)現(xiàn):與假誘導(dǎo)組相比,SE后0小時(shí)癲癇小鼠血清中S100β蛋白含量即有明顯升高(P=0.0022)。在SE后6 h、12 h、24 h小鼠血清中S100β蛋白含量均較假誘導(dǎo)組明顯升高(P0.001)。此后小鼠血清中S100β蛋白含量有下降趨勢(shì),SE后48h小鼠血清中S100β蛋白雖然較假誘導(dǎo)組有顯著升高(P=0.0085),但是較SE后24 h已有明顯降低(P=0.0156)。SE后30 d,小鼠血清中S100β蛋白含量仍較假誘導(dǎo)組明顯升高(P=0.0018)。3.SE后,在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)取小鼠的腦組織標(biāo)本,行免疫組化染色示:在SE后0 h,小鼠顳葉和海馬組織內(nèi)即有陽(yáng)性表達(dá)的白蛋白,散在分布于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外。SE后6 h、12 h和24 h,小鼠顳葉和海馬組織內(nèi)白蛋白的表達(dá)量明顯升高且呈上升趨勢(shì)。至SE后48 h,小鼠腦組織內(nèi)白蛋白的表達(dá)較前有所減少,呈下降趨勢(shì)。4.SE后24 h,測(cè)定假誘導(dǎo)組、生理鹽水組和ABAH組小鼠血清中S100β蛋白含量發(fā)現(xiàn):與假誘導(dǎo)組比較,生理鹽水組小鼠血清中S100β蛋白含量明顯升高(P=0.0004);ABAH組小鼠血清中S100β蛋白含量也顯著升高(P=0.0072);生理鹽水組小鼠血清中S100β蛋白含量較ABAH組明顯升高(P=0.0182)。5.SE后24 h,取假誘導(dǎo)組、生理鹽水組和ABAH組小鼠的腦組織標(biāo)本,行免疫組化染色示:在顳葉周圍的血管內(nèi),均存在大量陽(yáng)性表達(dá)的白蛋白顆粒,沿血管走形方向分布。其中,在假誘導(dǎo)組中,陽(yáng)性表達(dá)的白蛋白局限在血管內(nèi),血管周圍的顳葉組織只有極少量存在。而在生理鹽水組中,雖然陽(yáng)性表達(dá)的白蛋白主要存在于血管內(nèi),但是血管周圍的顳葉組織內(nèi)亦有大量存在。在ABAH組中,陽(yáng)性表達(dá)的白蛋白主要分布在血管內(nèi),但血管周圍的顳葉組織內(nèi)也存在少量陽(yáng)性表達(dá)的白蛋白顆粒。在海馬組織中,生理鹽水組白蛋白的表達(dá)量明顯比假誘導(dǎo)組和ABAH組高。6.在后續(xù)的行為學(xué)觀察中,生理鹽水組和ABAH組所有成功誘導(dǎo)SE的小鼠均出現(xiàn)SRS。與生理鹽水組比較,ABAH組SRS發(fā)生的時(shí)間延遲(180.8±3.544h vs 146.8±2.973h,P=0.0001),癲癇發(fā)作的頻率降低(0.176±0.007/h vs0.34±0.018/h,P0.0001)。7.SE后30 d,測(cè)定假誘導(dǎo)組、生理鹽水組和ABAH組小鼠血清中S100β蛋白含量發(fā)現(xiàn):與假誘導(dǎo)組比較,生理鹽水組小鼠血清中S100β蛋白含量明顯升高(P=0.0018);ABAH組S100β蛋白含量未見(jiàn)明顯升高(P=0.2819)。生理鹽水組S100β蛋白含量較ABAH組明顯升高(P=0.0187)。結(jié)論1.經(jīng)腹腔注射匹羅卡品誘導(dǎo)SE后,BBB通透性的變化具有時(shí)間模式,至24 h BBB通透性的變化最為明顯,可以作為SE發(fā)生后評(píng)估BBB通透性的重要時(shí)間節(jié)點(diǎn)。2.MPO特異性抑制劑ABAH可以降低BBB的通透性,同時(shí)延遲癲癇的復(fù)發(fā)時(shí)間,降低癲癇發(fā)作的頻率,對(duì)癲癇發(fā)作具有治療效應(yīng),表明MPO可能通過(guò)調(diào)節(jié)BBB的通透性參與SRS的發(fā)生,開(kāi)發(fā)新的靶向于MPO的抗炎藥物對(duì)癲癇的治療具有重大意義。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R742.1
【圖文】：

SE 后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)小鼠血清中 S100β 蛋白的含量（與假誘導(dǎo)組比較，***P<0.001）疫組化結(jié)果 0h、6h、12 h、24h、48h 和 30d 分別取小鼠腦組織標(biāo)本，免疫組化結(jié)果顯示：在 SE 后 0h，小鼠腦組織內(nèi)即有染成深褐箭頭所示），散在分布于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外，即陽(yáng)性表達(dá)的白蛋組織中均有陽(yáng)性表達(dá)。SE 后 6h、12h 和 24h，小鼠腦組織內(nèi)顯升高且有上升趨勢(shì)。至 SE 后 48h，小鼠腦組織內(nèi)白蛋白的，呈下降趨勢(shì)。（圖 2-2）0 h 6 h 12 h

2-1 SE 后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)小鼠血清中 S100β 蛋白的含量（與假誘導(dǎo)組比較，** P<0***P<0.001）3 免疫組化結(jié)果SE 后 0h、6h、12 h、24h、48h 和 30d 分別取小鼠腦組織標(biāo)本，行免疫色。免疫組化結(jié)果顯示：在 SE 后 0h，小鼠腦組織內(nèi)即有染成深褐色的顆質(zhì)（箭頭所示），散在分布于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外，即陽(yáng)性表達(dá)的白蛋白，在海馬組織中均有陽(yáng)性表達(dá)。SE 后 6h、12h 和 24h，小鼠腦組織內(nèi)白蛋白量明顯升高且有上升趨勢(shì)。至 SE 后 48h，小鼠腦組織內(nèi)白蛋白的表達(dá)較減少，呈下降趨勢(shì)。（圖 2-2）0 h 6 h 12 h

圖 3-2 在 SE 后 24 h，小鼠腦組織內(nèi)白蛋白的免疫組化染色（40X）3.3.4 癲癇復(fù)發(fā)行為學(xué)觀察結(jié)果成功誘導(dǎo) SE 后，繼續(xù)觀察記錄各組癲癇的復(fù)發(fā)情況。行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：假誘導(dǎo)組小鼠自始至終無(wú)癲癇發(fā)作；生理鹽水組所有小鼠均出現(xiàn)癲癇的自發(fā)性反復(fù)發(fā)作；ABAH 組所有的小鼠也均出現(xiàn)癲癇的自發(fā)性反復(fù)發(fā)作。與生理鹽水組比較，ABAH 組小鼠癲癇發(fā)作的時(shí)間延遲（180.8±3.544hvs146.8±2.973h，P=0.0001），癲癇發(fā)作的頻率降低（0.176± 0.007/h vs 0.34±0.018/h，P<0.0001）。癲癇發(fā)作時(shí)間是指每只小鼠從成功誘導(dǎo) SE 后至首次發(fā)生癲癇的時(shí)間。癲癇發(fā)作頻率是指每只小鼠在首次發(fā)生癲癇后，在隨后的觀察期間每小時(shí)癲癇發(fā)作的次數(shù)。（圖 3-3，3-4）1 6 01 8 02 0 0RSonset(hour)P = 0 . 0 0 0 1

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本文編號(hào)：2791651