【摘要】：研究背景和目的多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis,MS)是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘為病理特點的慢性自身免疫性疾病。多發(fā)性硬化病因不明,其發(fā)病過程與CD4~+T細胞分化密切相關。實驗性自身免疫性腦脊髓炎動物(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是目前研究多發(fā)性硬化最為適宜的模型,對于疾病發(fā)生過程中異常免疫反應有較好模擬作用。在多發(fā)性硬化和實驗性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)病過程中,激活的CD4~+T細胞在髓鞘抗原刺激下分化成分泌不同炎性因子的輔助型T細胞亞群(Helper T cells,Th cells)。促炎性輔助型T細胞和抑炎免疫調(diào)節(jié)型T細胞之間的免疫失衡,是導致疾病發(fā)生發(fā)展的主要原因。氫氣是自然界中一種無色無味的氣體。近年來發(fā)現(xiàn)氫氣具有選擇性抗氧化作用,因為安全簡單,可能適用于多種急慢性病的治療。由于氫氣分子量小且缺乏極性,使得氫分子具有強大的組織擴散能力,可迅速穿過血腦屏障抵達中樞神經(jīng)系統(tǒng)。但擴散能力強也容易降低氫氣的體內(nèi)存留時間和劑量,采用吸入氫氣的方法可保證在體存留時間和給氣劑量,對于發(fā)揮氫氣的治療作用有其獨特的優(yōu)勢。本課題研究目的在于證實氫氣吸入對于實驗性自身免疫性腦脊髓炎的治療作用,并探究保護作用機制。本研究主要分為三個部分:第一部分呼吸氫氣對實驗性自身免疫性腦脊髓炎動物的治療作用目的:中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性細胞的浸潤和大范圍的髓鞘脫失以及軸索損傷是多發(fā)性硬化和實驗性自身免疫性腦脊髓炎的病理學特點。氫氣作為一種新型抗氧化劑越來越受到人們重視。本實驗擬采用實驗性自身免疫性腦脊髓炎動物為研究對象,通過給與高濃度氫氣吸入方式,探討氫氣對于實驗性自身免疫性腦脊髓炎動物的治療作用。方法:建立實驗性自身免疫性腦脊髓炎動物模型,采用隨機數(shù)字表法共分為4組(n=12):正常組(Ctrl組),實驗性自身免疫性腦脊髓炎組(EAE組),實驗性自身免疫性腦脊髓炎吸入高濃度氫氣組(EAE+HCH組),實驗性自身免疫性腦脊髓炎吸入氮氧混合氣組(EAE+HCN組)。EAE+HCH組和EAE+HCN組小鼠自致免后第12天開始每日吸入氫氧混合氣或氮氧混合氣2個小時。每日進行神經(jīng)行為學評分和體重稱量;致免后第21天進行老鼠處死和組織取材的工作,采用HE染色和勒克斯速藍(Luxol fast blue,LFB)染色進行組織形態(tài)學的觀察評分;采用免疫組化方法觀察脊髓中T細胞數(shù)量的變化;通過酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測脊髓勻漿裂解液中炎性因子含量改變。結(jié)果:與Ctrl組相比,EAE組第9天開出現(xiàn)尾部肌肉張力喪失,逐漸擴散到單或雙下肢,同時伴隨體重下降,組織形態(tài)學觀察到中樞神經(jīng)系統(tǒng)腰膨大部分炎性細胞浸潤和大量脫髓鞘和軸索損傷,相同切片區(qū)域中大量CD4~+T細胞浸潤,脊髓裂解液中炎性因子TNF-α、IFNγ和IL-1β含量升高;與EAE組相比,EAE+HCN組各種檢測指標均未見明顯改變;與EAE組相比,EAE+HCH組神經(jīng)行為學和體重缺失有所緩解,中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性細胞浸潤和脫髓鞘情況得到明顯改善,T細胞數(shù)量減少,炎性因子TNF-α、IFNγ和IL-1β含量降低而抗炎因子IL-10含量升高。結(jié)論:氫氣吸入能改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性細胞浸潤和脊髓髓鞘脫失,減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)T細胞浸潤,降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥水平。結(jié)果顯示,吸入高濃度氫氣對實驗性自身免疫性腦脊髓炎具有治療效應。第二部分呼吸氫氣對實驗性自身免疫性腦脊髓炎動物免疫細胞的影響及機制探討目的:有關多發(fā)性硬化的發(fā)病機制尚不完全明確,異常免疫反應在多發(fā)性硬化發(fā)病過程中起到重要作用。氫氣作為一種抗氧化、抗炎和抗凋亡的新型治療手段,吸入氫氣是否對免疫細胞有調(diào)節(jié)作用是我們這一部分探究的內(nèi)容。通過建立實驗性自身免疫性腦脊髓炎動物,探討氫氣對免疫細胞以及輔助型T細胞的影響。方法:建立實驗性自身免疫性腦脊髓炎動物模型,采用隨機數(shù)字表法共分為兩組(n=12):實驗性自身免疫性腦脊髓炎組(EAE組)和實驗性自身免疫性腦脊髓炎吸入高濃度氫氣組(EAE+HCH組)。EAE+HCH組自致免后第12天開始每日吸入高濃度氫氣2個小時。實驗第19天進行小鼠處死和組織取材工作,將小鼠脊髓和腦以及小鼠脾臟分別制備單細胞懸液,體外MOG 35-55刺激培養(yǎng)。48小時后流式細胞學檢測各型免疫細胞的數(shù)量和比例;收集培養(yǎng)液上清液進行酶聯(lián)免疫吸附法分析細胞因子;采用RT-PCR進行mRNA轉(zhuǎn)錄因子水平測定。結(jié)果:與EAE組相比,EAE+HCH組小鼠的CD4~+T細胞和CD11b~+小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脾臟細胞的數(shù)量和比例都降低,CD19~+細胞的數(shù)量和比例兩組之間并無明顯差異;與EAE組相比,EAE+HCH組的Th17細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脾臟的數(shù)量和比例均下降,ELISA顯示IL-17的含量減少,RT-PCR結(jié)果顯示RORγt表達水平下降。其他輔助型T細胞,包括Th1細胞、Th2細胞和Treg細胞數(shù)量,以及細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子水平在兩組之間不存在差異。結(jié)論:高濃度氫氣吸入可減少CD4~+T和CD11b小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脾臟中的數(shù)量和比例;高濃度氫氣吸入可減少Th17數(shù)量和比例,減少其分泌的細胞因子以及轉(zhuǎn)錄水平。第三部分分子氫通過調(diào)節(jié)ROS/NLRP3通路發(fā)揮對Th17細胞分化的抑制作用目的:分泌IL-17炎性因子的Th17細胞在多發(fā)性硬化和實驗性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)病過程中發(fā)揮非常重要的作用。NLRP3及其相關蛋白分子與多發(fā)性硬化和實驗性自身免疫性腦脊髓炎的疾病嚴重程度密切相關。本部分擬采用體內(nèi)和體外實驗,來探究氫氣對于Th17細胞分化的抑制作用是否通過調(diào)節(jié)ROS/NLPR3通路引起。方法:本部分研究分為兩個階段:第一階段,建立實驗性自身免疫性腦脊髓炎動物,采用隨機數(shù)字表法共分為兩組(n=12):實驗性自身免疫性腦脊髓炎組(EAE組),實驗性自身免疫性腦脊髓炎吸入高濃度氫氣組(EAE+HCH組),EAE+HCH組自致免后第12天開始每日吸入高濃度氫氣2個小時。另外設有正常對照組(Ctrl組,n=12)。于實驗第19天進行組織取材,小鼠脾臟制備單細胞懸液進行體外培養(yǎng)。48小時后采用流式細胞術(shù)分析CD4~+T細胞中DCFHDA的含量變化;采用western blot的方法檢測NLPR3相關蛋白的表達水平。第二階段:從野生型小鼠脾臟制備的單細胞懸液進行磁性負性分離na?ve T細胞,再進行Th17細胞定向分化,分別給與ATP和(或)富氫培養(yǎng)基處理。采用流式細胞術(shù)分析Th17細胞的數(shù)量,采用western blot檢測NLRP3相關蛋白表達水平。結(jié)果:與Ctrl組相比,EAE組的CD4~+T細胞中ROS含量明顯上升,而氫氣吸入(EAE+HCH組)可以減少CD4~+T細胞中ROS的含量。與EAE組相比,EAE+HCH組的CD4~+T細胞中IL-1β、Caspase-1和NLRP3蛋白表達水平下降。在體外Th17細胞定向分化過程中實驗中,經(jīng)ATP處理的Th17細胞數(shù)量增加,IL-1β、Caspase-1和NLRP3蛋白表達含量升高;加入富氫培養(yǎng)基處理后,Th17細胞數(shù)量減少,IL-1β、Caspase-1和NLRP3蛋白表達水平降低。結(jié)論:氫氣通過減少CD4~+T細胞內(nèi)ROS的水平,發(fā)揮對NLRP3及其下游蛋白Caspase-1和IL-1β的抑制作用,進一步導致了Th17細胞分化數(shù)量的降低。綜上所述,呼吸氫氣可改善實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠神經(jīng)功能損傷和體重喪失,減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應和髓鞘脫失;氫氣可降低CD4~+T細胞和CD11b~+小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脾臟中數(shù)量和比例,減少實驗性自身免疫性腦脊髓炎動物中Th17細胞數(shù)量比例及特異性炎性因子表達;氫氣能夠通過降低CD4~+T細胞內(nèi)活性氧自由基的水平,抑制NLRP3炎性小體激活和下游效應因子表達,發(fā)揮對Th17細胞分化過程抑制作用。研究結(jié)果提示,高濃度氫氣吸入作為一種給氫方法,對實驗性自身免疫性腦脊髓炎具有治療作用,其機制可能是氫氣抗氧化抑制了NLRP3炎性小體激活和效應因子釋放,導致了Th17細胞分化數(shù)量的減少,進而緩解了免疫炎癥反應。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R744.51
【圖文】：

吸 對實驗性自身免疫性腦脊髓炎的保護作用和機制研究- 33 -圖1 氫氣吸入對EAE小鼠的神經(jīng)行為學評分及體重稱量的影響Figure 1. Effects of inhalation of high concentrated hydrogen on clinical scores andweight loss. A, Hydrogen treatment was administrated 2h per day from the onset of clinicalsymptoms (Day 12 post immunization, marked by arrow). EAE+HCN group was givenmixed gas containing 67% N2and 33% O22h each day from day 12. B, body weight wasmonitored weekly. Data are presented as mean ± standard error of the mean (n=12).Compared with group Ctrl,###p < 0.001; Compared with group EAE, *p < 0.05, **p < 0.01,***p < 0

圖 2 氫氣吸入對 EAE 小鼠脊髓炎性浸潤和髓鞘脫失以及 CD4+T 細胞的Figure 2. Inhalation of high concentration of hydrogen could ameliolammatory infiltrates, demyelination and CD4+T cells in spinal cord. A, sptions collected from mice at 21 day after immunization were stained with H&Ew the regions of infiltrative inflammatory cells); B, the same sections were sta

圖 3 氫氣對脊髓組織中細胞因子 TNF-α、IFN-γ、IL-1β 和 IL-10 的影響。Figure 3. Inhalation of high concentration of hydrogen could mitigate the increasedinflammatory cytokine induced by EAE. Spinal cord tissue lysate was collected at Day 21after immunization, and were assessed by Elisa assay for A. TNF-α；B. IFN-γ；C. IL-1β；

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本文編號：2791172