【摘要】：背景多系統(tǒng)萎縮(multiple system atrophy,MSA)是一種原因不明的、少見的、致命的遲發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)變性病,目前尚無有效的治療方法。其臨床癥狀主要表現(xiàn)為自主神經(jīng)功能障礙、左旋多巴非敏感性帕金森癥狀及小腦性共濟失調(diào),常以某一系統(tǒng)損害為突出表現(xiàn),伴隨其他癥狀的相互疊加組合。迄今為止,MSA的發(fā)病機制仍然不明。MSA與帕金森病(Parkinson’s disease,PD),路易體癡呆(dementia with Lewy bodies,DLB),單純性自主神經(jīng)功能障礙(pure autonomic failure,PAF)等具有共同的病理特征,即錯誤折疊的α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)在神經(jīng)系統(tǒng)中的異常沉積并在細胞內(nèi)形成包涵體,這類疾病統(tǒng)稱為α-突觸核蛋白病。細胞及動物模型研究發(fā)現(xiàn)α-syn蛋白異構(gòu)體可以像“朊蛋白”一樣,誘導(dǎo)正常的α-syn蛋白異常折疊,形成包涵體,并在細胞間播散。因此,有學(xué)者提出α-syn陽性包涵體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的形成及播散可能是α-突觸核蛋白病共有的病理機制。臨床統(tǒng)計學(xué)資料顯示,大約65%的MSA患者的泌尿障礙出現(xiàn)時間早于運動障礙,且男性患者勃起功能障礙通常是首發(fā)癥狀,早于泌尿癥狀出現(xiàn)。MSA病程初期尿頻、尿失禁的發(fā)生率為88%-100%,男性性功能障礙發(fā)生率為74%-84%。MSA的病理改變波及范圍廣泛,神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細胞內(nèi)存在α-syn陽性包涵體是其特征性病變。MSA患者尸檢發(fā)現(xiàn),除了在尾狀核、殼核、蒼白球、黑質(zhì)、橋腦核、小腦浦肯野細胞等部位能測到α-syn陽性包涵體外,在導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(periaqueductal gray matter,PAG)、腦橋排尿中樞(pontinemicturition center,PMC)、L6-S1階段骶副交感核(sacralparasympathetic nucleus,SPN)、脊髓中間外側(cè)核(intermediolateral column,IML)、L6脊髓前角腹外側(cè)Onuf核等泌尿生殖相關(guān)自主神經(jīng)傳導(dǎo)通路中也檢測到α-syn陽性包涵體的存在,這可能是導(dǎo)致MSA患者早期出現(xiàn)泌尿生殖功能障礙的原因。因此,我們推測α-syn陽性包涵體可能從膀胱逼尿肌神經(jīng)末梢沿泌尿生殖相關(guān)自主神經(jīng)通路逆行播散至大腦導(dǎo)致MSA癥候群。目的本實驗通過構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型,研究α-syn陽性包涵體是否可以沿泌尿生殖相關(guān)自主神經(jīng)通路逆行播散至大腦,模擬MSA患者的自主神經(jīng)功能障礙及運動障礙,并進一步探討MSA可能的發(fā)病機制。方法1.本研究收集了MSA患者8例,PD及進行性核上性麻痹(Progressive supranuclear palsy,PSP)患者各6例,以及正常對照組6例,收集其膀胱逼尿肌標本,通過免疫組織化學(xué)染色的方法檢測其是否有病理性α-syn沉積。2.制備α-syn纖維體,并通過透射電鏡鑒定其形態(tài)。3.建立轉(zhuǎn)基因小鼠模型,將α-syn纖維體注射至小鼠膀胱逼尿肌,通過免疫組織化學(xué)染色、雙重免疫熒光標記評估α-syn陽性包涵體的形成及播散情況,通過肛周肌電圖、尿動力學(xué)檢測、行為學(xué)測試評估小鼠的自主神經(jīng)功能及運動功能改變。結(jié)果1.病人標本免疫組織化學(xué)染色顯示病理性α-syn存在于MSA患者的膀胱逼尿肌神經(jīng)末梢中,而PD、PSP及正常對照的逼尿肌中不存在。2.小鼠模型組織學(xué)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因小鼠的逼尿肌注射α-syn纖維體后,在小鼠的泌尿生殖自主神經(jīng)通路上檢測到α-syn陽性包涵體的沉積。3.小鼠模型行為學(xué)結(jié)果顯示,實驗組小鼠早期就能檢測肛周肌電圖異常及尿動力學(xué)異常,隨后出現(xiàn)運動表型。結(jié)論1.在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中,α-syn陽性包涵體可以沿泌尿生殖相關(guān)自主神經(jīng)通路逆行播散至大腦。2.在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中,α-syn陽性包涵體沿泌尿生殖相關(guān)自主神經(jīng)通路的播散模擬了MSA患者自主神經(jīng)功能障礙及運動障礙。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R741
【圖文】：

結(jié)果T 中檢測到病理性 α-syn 異常沉積 pα-syn 抗體和抗 α-syn filament 抗體檢測病人及對照組 DET α-syn 的異常沉積（圖 1）。在 8 例 MSA 患者中，有 6 例病人性的 α-syn 沉積物（圖 1）。然而，我們未在 PD 及 PSP 病人理性的 α-syn（圖 1）。此外，在 6 名對照組受試者的 DET 中性的 α-syn 沉積（圖 1）。

化學(xué)結(jié)果顯示，少量 α-syn 包涵體沉積在 DET 及盆神經(jīng)節(jié)，此外，在脊髓的 S1，L6 及 L2 水平檢測到大量 α-syn 陽性包涵體，其主要存在于 V-VII 和 IX 板層；在腦中，α-syn 陽性包涵體存在于腦橋和中腦。我們的結(jié)果表明，α-syn 陽性包涵體沉積在泌尿反射相關(guān)通路上，包括 Onuf 核、IML、PAG、腦橋巴靈頓核（Barrington’s nucleus, BN）和 LC。此外，我們發(fā)現(xiàn) α-syn 包涵體也沉積于錐體外系。這些與 MSA 尸檢的病理結(jié)果是一致的。上述結(jié)果表明，病理性 α-syn 可以通過泌尿生殖自主神經(jīng)相關(guān)通路逆向播散至大腦，導(dǎo)致廣泛的 α-syn 陽性包涵體形成。然后，我們使用雙重免疫熒光染色進一步探究 α-syn 組小鼠中的 α-syn 陽性包涵體的性質(zhì)及分布特點（圖 3）。首先，通過抗 pα-syn 抗體與泛素化抗體Ub 及小膠質(zhì)細胞標記物抗 Iba-1 抗體的雙重免疫熒光染色，我們發(fā)現(xiàn) α-syn 陽性包涵體與 Ub 和 Iba-1 有共定位，提示泛素化及小膠質(zhì)細胞激活參與了 α-syn陽性包涵體形成的病理過程；此外，我們觀察到與 PBS 組相比，α-syn 組小鼠脊髓中 MBP 和 NF 的表達明顯減少，提示在 α-syn 陽性包涵體的播散過程中，伴隨著軸突病變及脫髓鞘改變。

圖 3 通過雙重免疫熒光染色檢測各組小鼠不同層面 α-syn 的分布情況。A-B. L2, C. 小腦,D-E. L2, F. 腦橋, G. 中腦, 比例尺 500 μm (A1, C1); 200 μm (B1, F1); 100 μm(F2-F3); 50 μm(A2, B2, C2, D, E, G)。3α-syn 組小鼠早期出現(xiàn) EAS EMG 失神經(jīng)支配-神經(jīng)再支配改變首先，使用 20 只年齡匹配的健康雄性 TgM83+/-小鼠作為正常對照，在這些小鼠中未檢測到異常 EAS EMG�；谝酝奈墨I，如果出現(xiàn)下列任意一種波形，則定義為異常的 EAS EMG：（1）纖顫電位；（2）正銳波；（3）復(fù)雜重復(fù)放電；（4）束顫電位；（5）肌顫搐；（6）衛(wèi)星電位。結(jié)果顯示，α-syn 組小鼠在造模后 2 個月即出現(xiàn)異常的 EAS EMG，而 PBS組中未檢測到異常，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖 5, p<0.05）。我們進一步觀察了 α-syn組小鼠中異常 EAS EMG 的出現(xiàn)率：在造模后 2 個月，4 個月及 6 個月時，分別

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4 楊海O

本文編號：2790737