【摘要】：目的:癲癇是由于神經(jīng)元突然異常放電引起,并可導(dǎo)致短暫性腦功能障礙的慢性疾病。海人酸(KA)誘導(dǎo)的顳葉癲癇模型已被廣泛運(yùn)用于研究癲癇疾病的發(fā)病機(jī)制。最近有研究表明,血腦屏障(BBB)已成為治療癲癇的一個(gè)創(chuàng)新型研究方向。在KA誘導(dǎo)的癲癇模型中KA可引起神經(jīng)元損傷和BBB損傷,但是關(guān)于癲癇相關(guān)的神經(jīng)元損傷、自噬和BBB損傷之間的關(guān)聯(lián)及相互作用機(jī)制的研究較少。因此,本文通過ICR雄性小鼠建立海人酸(KA)誘導(dǎo)的顳葉癲癇,于KA給藥后測(cè)定海馬CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量的變化、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化、及自噬相關(guān)蛋白、BBB緊密連接(TJ)蛋白的表達(dá),從而探討了癲癇急性期神經(jīng)元損傷,自噬相關(guān)蛋白表達(dá)與BBB相關(guān)蛋白變化之間的關(guān)系,從而進(jìn)一步了解癲癇發(fā)病的相關(guān)病理改變。此外,這些試驗(yàn)結(jié)果為癲癇患者提供了新的治療靶點(diǎn),并為癲癇的治療提供新的研究治療方向。方法:將KA通過立體定位儀注射至每只小鼠的單側(cè)側(cè)腦室(相對(duì)于前囟的-1.0mm,-0.22mm和-0.3mm)。將成年的雄性ICR小鼠隨機(jī)分為7組(每組n=14;7只動(dòng)物用于組織學(xué)分析,7只動(dòng)物用于生化分析)如下:生理鹽水組(對(duì)照組),3μg/kg海人酸組(3μg/kgKA組),I0μg/kg海人酸組(10μg/kg KA組)。3天后處死生理鹽水組(對(duì)照組),3μg/kg海人酸組(3μg/kg KA組),1Oμg/kg海人酸組。KA注射后,10μ_g/kgKA組根據(jù)時(shí)間再分為4個(gè)亞組(每組n=14;7組動(dòng)物用于組織學(xué)分析,7組動(dòng)物用于生化分析):6小時(shí),24小時(shí),48小時(shí)和72小時(shí)。注射后,將所有動(dòng)物放回籠中,使用改良的Racine量表評(píng)估癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度:階段0,正常行為;階段1,小鼠禁止不動(dòng);第2階段,前肢和/或尾巴伸展,肢體僵硬;第3階段,頭部不自主抖動(dòng);第4階段,小鼠站立不穩(wěn);階段5,小鼠持續(xù)失衡跌倒;階段6,強(qiáng)直性發(fā)作甚至死亡。免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NeuN標(biāo)記的神經(jīng)元核抗原、FJB標(biāo)記損傷的神經(jīng)元與Ibal標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞、GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞、PECAM-1標(biāo)記的血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1、ZO-1標(biāo)記的胞質(zhì)緊密粘連蛋白1,蛋白印跡法測(cè)定LC31/Ⅱ、Beclin-Ⅰ、Claudin5、ZO-1的蛋白表達(dá)。結(jié)果:(1)10μg/kg KA組小鼠有明顯的癲癇發(fā)作,且其海馬CA3區(qū)可見明顯的神經(jīng)細(xì)胞損傷。(2)在注射10μg/kg KA的小鼠中,KA注射后6小時(shí)海馬中Beclin-1的蛋白質(zhì)印跡表達(dá)水平自6小時(shí)KA注射后至48小時(shí)逐漸升高。然而,KA注射后72小時(shí)與KA注射后48小時(shí)相比有小幅下降。KA注射后6小時(shí)海馬中的LC311/LC3I水平逐漸升高并且在24小時(shí)達(dá)到峰值;其蛋白水平在48和72小時(shí)逐漸下降,但仍高于對(duì)照組水平。(3)10μg/kgKA組的Iba-1免疫反應(yīng)性顯示為小的扁橢圓形的胞體,軸突細(xì)長(zhǎng)呈分支狀,且活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量在海馬CA3區(qū)中顯著增加。在3μg/kg KA和10μg/kg KA組中,GFAP +細(xì)胞的活化和免疫反應(yīng)性與對(duì)照組相比顯著增加。(4)注射10μg/kg KA后24小時(shí)和48小時(shí),海馬CA3區(qū)PECAM-1免疫反應(yīng)逐漸升高。注射10μg/kg KA 72小時(shí)后,其免疫反應(yīng)性與48小時(shí)相比略有下降。在注射后24,48和72小時(shí),這些組在海馬CA3區(qū)的ZO-1免疫反應(yīng)性中沒有表現(xiàn)出差異,但是它們的免疫反應(yīng)顯著高于對(duì)照組和6小時(shí)組。(5)在注射后24,48和72小時(shí),Claudin-5的蛋白水平顯著高于對(duì)照組和6小時(shí)組。注射后6小時(shí)至72小時(shí),海馬中ZO-1蛋白水平與對(duì)照組相比逐漸升高。結(jié)論:(1)KA可誘導(dǎo)海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷可能與自噬相關(guān)的Beclin-1和LC311水平的變化有關(guān),這說明自噬參與了神經(jīng)元的損傷。(2)KA誘導(dǎo)癲癇模型中觀察到的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化,這可能與神經(jīng)元死亡和BBB損傷有關(guān)。(3)TJ蛋白(如ZO-1和Claudin-5)及PECAM-1表達(dá)的短暫性增加可能與海馬CA3區(qū)中神經(jīng)元損傷相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明:KA誘導(dǎo)的海馬CA3區(qū)神經(jīng)元死亡與自噬有關(guān)。此外,星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,PECAM-1,ZO-1和Claudin-5表達(dá)的早期短暫性增加可能與神經(jīng)元損傷密切相關(guān)。然而,我們只評(píng)估了癲癇急性期自噬,BBB和神經(jīng)元損傷的變化。需要進(jìn)一步使用藥物干預(yù)來驗(yàn)證自噬和BBB損傷在神經(jīng)元死亡中的作用。這些結(jié)果將為治療癲癇提供新的治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R742.1
【圖文】：

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本文編號(hào)：2789857