【摘要】：背景帕金森病(PD)是最常見的神經(jīng)退行性疾病之一,其發(fā)病率僅次于阿爾茲海默癥(AD)。PD典型的病理特征為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的退行性死亡。該病在我國患病人數(shù)居世界第一,并以每年增加10萬患者的速度遞增,且該病治療方法和效果均有限,因此PD給我國公共衛(wèi)生事業(yè)帶來了巨大的挑戰(zhàn)。目前,越來越多的研究表明,α-synuclein的異常聚集和線粒體功能紊亂與PD的發(fā)病有關,但是其中的具體機制尚不清楚。絲氨酸/蘇氨酸激酶p38MAPK在細胞內(nèi)通過調(diào)控各種細胞信號通路的信號轉導,影響著細胞內(nèi)多種活動進程。已有研究表明,p38MAPK的激活與細胞內(nèi)線粒體功能紊亂有關,但其中的具體機制尚不清楚。線粒體分裂對保持線粒體穩(wěn)態(tài),維持線粒體功能來說十分重要,而線粒體動力相關蛋白Drp1是調(diào)控細胞內(nèi)線粒體分裂的一種重要的GTP酶。很多研究表明,在PD中,Drp1的激活導致線粒體分裂異常,從而導致線粒體和細胞的功能損傷。Drp1可受多種激酶的調(diào)控,其中p38lMAPK與Drp1的關系尚未有報道。本研究旨在闡明在PD中p38MAPK、Drp1與線粒體穩(wěn)態(tài)之間的聯(lián)系和具體調(diào)控機制,為帕金森病的治療策略提供理論基礎和新思路。目的1.探索α-synuclein對線粒體功能和細胞功能的影響;2.明確p38MAPK是否參與α-synuclein誘導的線粒體穩(wěn)態(tài)失衡和神經(jīng)元死亡;3.明確Drp1是否參與α-synuclein誘導的線粒體穩(wěn)態(tài)失衡和神經(jīng)元死亡;4.明確p38MAPK是否參與調(diào)控Drp1。方法1、Mito tracker染料標記細胞內(nèi)線粒體2、JC-1檢測SN4741細胞線粒體的膜電位3、流式細胞術檢測細胞的凋亡水平4、質(zhì)粒的轉化、細胞內(nèi)轉染質(zhì)粒5、蛋白免疫印跡法檢測細胞內(nèi)蛋白的表達水平6、細胞線粒體提取法檢測蛋白在細胞內(nèi)的分布7、免疫共沉淀法(Co-IP)檢測細胞內(nèi)兩蛋白間的相互結合和作用結果1.α-synucleinA53T誘導SN4741細胞線粒體功能紊亂和細胞凋亡;2.α-synuclein A53T可激活p38MAPK,藥物抑制或轉染p38MAPK激酶失活型質(zhì)粒均可恢復線粒體功能,減少細胞凋亡;3.α-synuclein A53T可激活Drp1,導致Drp1磷酸化和線粒體轉位,且使用Drp1抑制劑可恢復線粒體功能,減少細胞凋亡;4.抑制p38MAPK可以抑制Drp1的活性,導致其磷酸化和線粒體轉位減少;5.p38MAPK與Drp1可相互結合,α-synuclein A53T可導致二者結合增加,抑制p38MAPK可導致兩者結合減少。結論α-synuclein A53T誘導激活p38MAPK,激活的p38MAPK通過誘導Drp1磷酸化及其線粒體轉位激活Drp1,從而介導線粒體分裂異常,導致線粒體功能紊亂和神經(jīng)元死亡。抑制Drp1和p38MAPK均可恢復線粒體功能,減少神經(jīng)元死亡。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R742.5
【圖文】：

使用線粒體染色試劑Ｍｉｔｏ邋ｔｒａｃｋｅｒ分別對轉染了空載體質(zhì)粒、Ａ５３Ｔ質(zhì)粒的ＳＮ４７４１逡逑細胞的線粒體進行染色，以觀察ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ邋Ａ５３Ｔ過表達對線粒體形態(tài)的影響。逡逑如圖１．１所示，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到的紅色部分為線粒體�？梢钥吹�，逡逑與轉染了空載質(zhì)粒的對照組相比，轉染了邋Ａ５３Ｔ的細胞中，點狀的線粒體明顯增逡逑多，線粒體的碎片化增多。用ｉｍａｇｄ軟件進行分析后也發(fā)現(xiàn)，轉染Ａ５３Ｔ的組細逡逑胞的線粒體平均長度明顯小于對照組，且該差異具有統(tǒng)計學意義（ｐ＜０．０１，ｎ＝３）。逡逑此結果表明，ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ邋Ａ５３Ｔ過表達導致ＳＮ４７４１細胞線粒體形態(tài)發(fā)生改變，即逡逑分裂增多，線粒體的碎片化增多。逡逑ＭＩＴＯ逡逑■ｍ邐ｒ，邐＾逡逑ｍＳｍ邐ｒ．逡逑１邋0邐ＡＳ３Ｔ逡逑圖１．１邋ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ邋Ａ５３Ｔ過表達處理ＳＮ４７４１細胞線粒體形態(tài)變化逡逑Ｆｉｇ．邋１邋？邋１邋Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｗａｓ邋ａｓｓｅｓｓｅｄ邋ｕｓｉｎｇ邋ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ邋ｔｒａｃｋｅｒ邋ｉｎ邋ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ邋Ａ５３Ｔ逡逑ＳＮ４７４１邋ｃｅｌｌｓ．邋Ｄａｔａ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｍｅａｎ邋土邋ＳＤ邋ｏｆ邋ｔｈｒｅｅ邋ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．邐＜邋０．０１．逡逑１．２邋ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ邋Ａ５３Ｔ導致ＳＮ４７４１細胞線粒體膜電位下降逡逑為進一步探究ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ邋Ａ５３Ｔ過表達對ＳＮ４７４１細胞線粒體功能的影響

而線粒體的功能受到損害時，線粒體的跨膜電位被去極化，ＪＣ－１被釋放，因而以逡逑單體的形式存在，表現(xiàn)為綠色熒光。因此，根據(jù)紅綠熒光的強度，可檢測出線粒逡逑體膜電位的變化。如圖１．２所示，相比于轉染了空載質(zhì)粒的對照組，轉染了邋Ａ５３Ｔ逡逑的細胞在鏡下觀察到的紅色熒光明顯減弱，綠色熒光增強。此結果說明轉染了逡逑Ａ５３Ｔ的ＳＮ４７４１細胞的線粒體膜電位被去極化，膜電位降低。此結果表明過表逡逑達ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎＡ５３Ｔ導致ＳＮ４７４１細胞的線粒體膜電位降低。逡逑ＪＣ－１邋ｍｏｍｏｍｅｒ邋ＪＣ－１邋ｐｏｌｙｍｅｒ邋Ｍｅｒｇｅ逡逑１邋：ｒｆ．邋／邋１邋邐二邐逡逑ＨＨ邋ｉ邋二逡逑圖１．２邋ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎＡ５３Ｔ過表達處理ＳＮ４７４１細胞線粒體膜電位變化逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｐｏｔｅｎｔｉａｌ邋ｗａｓ邋ａｓｓｅｓｓｅｄ邋ｂｙ邋ＪＣ－１邋ｉｎ邋ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ邋Ａ５３Ｔ邋ＳＮ４７４１逡逑ｃｅｌｌｓ．邋Ｄａｔａ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｍｅａｎ邋±邋ＳＤ邋ｏｆ邋ｔｈｒｅｅ邋ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．邋＊＊＊ｐ邋＜邋０．００１．逡逑１．３邋ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ邋Ａ５３Ｔ誘導ＳＮ４７４１細胞發(fā)生凋亡逡逑上述結果表明，ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ邋Ａ５３Ｔ過表達可導致線粒體分裂增多，線粒體片逡逑段化增多，且線粒體的膜電位下降，提示著ａ－ｓｙｍｉｃｌｅｉｎＡ５３Ｔ過表達可導致逡逑ＳＮ４７４１細胞的線粒體穩(wěn)態(tài)失衡。接下來

達對ＳＮ４７４１細胞功能的影響，我們分別對轉染了空載體質(zhì)粒、Ａ５３Ｔ質(zhì)粒的逡逑ＳＮ４７４１細胞進行收集，隨后，先后用Ａｎｎｅｘｉｎ－ＦＩＴＣ和ＰＩ兩種染料對細胞進行逡逑染色，最后使用流式細胞儀對細胞的凋亡情況進行檢測分析。如圖１．３所示，轉逡逑染了空載質(zhì)粒的對照組，細胞凋亡率為７．１６％，而轉染了邋Ａ５３Ｔ的處理組，細胞逡逑凋亡率達到了邋２５．３３％，細胞凋亡率明顯上升。該差異具有統(tǒng)計學意義０＜0．0１，逡逑ｎ＝３）。因此可得出結論，ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎＡ５３Ｔ過表達可誘導ＳＮ４７４１細胞發(fā)生凋亡。逡逑0１邋０２邋°１邋０２邋Ｍ逡逑０４９３％邐0３Ｍ％邐７Ｘ０％邐邐，逡逑ｉｏ３－邐．．＇潘邐ｉｏ３－邐r2？邐篆３０邐Ｉ逡逑２邋：：。廠邐Ｓ’邐丨：＿＿逡逑0：0４邐0３邐0邐0３逡逑邐邋邐２，＾，ｌ邐＂…丨邋Ｉ邐

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本文編號：2785075