【摘要】：人神經(jīng)膠質(zhì)瘤是目前已知的惡性程度最高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,也是發(fā)病率較高的顱內(nèi)惡性腫瘤。然而,由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度高,膠質(zhì)瘤細胞有很強的增殖能力、遷移和侵襲能力、抗凋亡能力,且膠質(zhì)瘤組織與周圍組織分界不清,呈浸潤性生長,手術治療很難完整切除。盡管現(xiàn)在醫(yī)療技術非常發(fā)達,但神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療效果仍沒有顯著提升,即使采用手術、化療、放射療法結合,其死亡率仍居高不下。因此,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者具有預防、診斷和治療意義的分子靶點,對于監(jiān)測和改善其惡性生物學行為具有重要的科學和臨床意義。近年來,越來越多的研究顯示,神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中存在人巨細胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染,及其病毒DNA和蛋白的表達,提示HCMV可能與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展存在某種聯(lián)系。此外,HCMV基因產(chǎn)物激活多種細胞因子,可促進腫瘤的演進和血管生成,如感染早期病毒IE1基因過表達能促進腫瘤的侵襲和轉移,促進膠質(zhì)瘤的發(fā)展。還有研究結果顯示,由于HCMV能刺激細胞生長因子的過度表達、激活原癌基因、抑制抑癌基因產(chǎn)物、感染細胞調(diào)控機制、增加細胞惡性特征的表達,因而在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用�；诖�,本研究檢測HCMV DNA、抗體,分析HCMV立刻早期基因1-72(IE1-72)蛋白和磷酸化糖蛋白65(pp65)在膠質(zhì)瘤組織中表達水平,探討IE1-72和pp65蛋白表達水平和神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床病理學特征的關系,并進一步采用體外實驗技術,構建IE1表達載體,成功轉染入神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細胞株,觀察細胞內(nèi)IE1 mRNA的表達;再分別檢測IE1過表達后,U251細胞的增殖、遷移、侵襲和抗凋亡能力的變化。目的分析神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者、外傷顱腦出血患者腦組織中HCMV抗原和核酸及外周血標本HCMV IgG和IgM抗體陽性率,觀察HCMV IE1對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞生物學特性的影響,探討HCMV與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的相關性。方法隨機收集39例腦膠質(zhì)瘤患者瘤組織標本及血液標本為實驗組(按照WTO病理學分級標準對瘤組織分類:I級星形細胞瘤3例,II級6例,III級16例,IV級14例),收集9例外傷顱腦出血外傷顱腦出血患者的腦組織標本及血液標本為對照組。(1)取患者血液標本,密度梯度離心分離外周血淋巴細胞,檢測淋巴細胞HCMV pp65抗原,ELISA方法檢測血清中HCMV IgG和IgM抗體,分別計算實驗組及對照組的抗原、抗體陽性率。(2)巢式PCR檢測技術檢測兩組組織標本和外周血中HCMV DNA中HCMV UL55基因,熒光定量PCR檢測其中HCMV DNA的拷貝數(shù)。(3)采用免疫組織化學實驗方法分析HCMV IE1-72和pp65抗原在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達水平。(4)構建攜帶HCMV IE1基因的質(zhì)粒pCDNA3.0-IE1,轉染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株U125,篩選出成功轉染細胞株,設為設HCMV IE1(U251-IE1)組,與細胞對照組和空質(zhì)粒對照組作比較,觀察轉染HCMV IE1基因后神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251-IE1生物學特性的變化;包括細胞增殖檢測(CCK-8試劑盒法)實驗,觀察轉染HCMV IE1對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖能力的影響,通過流式細胞術檢測細胞凋亡情況,分析轉染HCMV IE1基因后,是否影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞抗凋亡作用,細胞劃痕實驗和Transwell實驗分析轉染HCMV IE1對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞遷移及侵襲能力的影響。結果(1)外周血HCMV-IgG、IgM抗體檢測結果:39例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者外周血抗原血癥檢測結果均為陰性;36例患者(36/39,92.3%)HCMV IgG抗體陽性,顯著高于對照組(χ~2=33.2,P0.01);7例(7/39,17.9%)HCMV IgM抗體陽性,與對照組無顯著差異(χ~2=1.89,P0.05);對照組9例IgG抗體及IgM抗體均陰性。膠質(zhì)瘤組織和外周血中抗人巨細胞病毒IgM陽性率與病毒DNA拷貝數(shù)呈顯著正相關(r=0.76,P0.01)。HCMV IgM陽性患者的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織HCMV IE1-72和pp65抗原蛋白均陽性;3例HCMV IgG陰性患者的血液及瘤組織HCMV DNA結果陰性。(2)實驗組膠質(zhì)瘤組織標本及外周血HCMV DNA實驗結果:實驗組25例(25/39,64.1%)患者瘤組織細胞檢出HCMV UL55基因,其中I、II、III、IV級星形細胞瘤的陽性率分別為66.7%(2/3)、50%(3/6)、68.8%(11/16)、64.3%(9/14);25例基因陽性患者中23例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織的IE1-72和pp65蛋白抗原均為陽性,另2例HCMV DNA檢測陽性的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織IE1-72和pp65陰性。同時,有5例IE1-72陽性的標本未檢出HCMV DNA。對照組9例外傷顱腦出血患者的腦組織中均未檢出HCMV DNA。巢式PCR技術檢測膠質(zhì)瘤20例(20/39,51.3%)患者外周血HCMV DNA陽性,其中I、II、III、IV級星形細胞瘤的陽性率分別為66.7%(2/3)、33.3%(2/6)、50%(8/16)57.1%(8/14)。外周血HCMV DNA陽性率與腦膠質(zhì)瘤組織中HCMV的檢出無顯著相關性;5例患者外周血HCMV DNA檢測陰性,而神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織HCMV DNA均檢出為陽性。DNA測序證實所有PCR擴增產(chǎn)物的序列與HCMV UL55完全一致。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤每500ng組織中及外周血液中平均log10 HCMV DNA拷貝數(shù)分別為(3.75±1.60)、(2.88±1.20),對照組分別為(1.66±0.19)、(1.54±0.12);實驗組膠質(zhì)瘤組織標本及血液標本HCMV DNA陽性率均顯著高于對照組(P0.01),在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和外周血中HCMV DNA拷貝數(shù)均低于典型的活動性感染時HCMV DNA拷貝數(shù)(平均log10 HCMV DNA拷貝數(shù)為9.507)。(3)組織標本免疫組化檢測結果:實驗組共有30例(30/39,76.9%)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者瘤組織HCMV IE1-72為陽性,其中I、II、III、IV級星形細胞瘤的陽性率分別為66.7%(2/3)、83.3%(5/6)、75.0%(12/16)、78.6%(11/14);26例(26/39,66.7%)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者瘤組織HCMV pp65陽性,其中I、II、III、IV級星形細胞瘤的陽性率分別為66.7%(2/3)、66.7%(4/6)、56.3%(9/16)、78.6%(11/14)。其中26例pp65陽性標本其IE1-72均為陽性,30例IE1-72陽性的標本中4例為pp65陰性;而對照組9例外傷顱腦出血患者腦組織HCMV IE72和pp65抗原均陰性;實驗組HCMV IE1-72及PP65陽性率均顯著高于對照組(P0.01)。(4)HCMV IE1對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞生物學特性的影響:向U251細胞內(nèi)轉染HCMV IE基因后篩選成功轉染細胞株,CCk-8法實驗結果顯示轉染HCMV IE1基因后U251細胞的增殖能力較空質(zhì)粒對照組和細胞對照組顯著增強(P0.05),而空質(zhì)粒對照組和細胞對照組細胞的增殖能力無顯著性差異,表明HCMV IE1基因具有促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖的能力;流式細胞術分析轉染HCMV IE1組、空質(zhì)粒對照組和細胞對照組細胞的凋亡水平發(fā)現(xiàn)轉染HCMV IE1基因后U251細胞的抗凋亡能力較空質(zhì)粒對照組和細胞對照組顯著增強,而空質(zhì)粒對照組和細胞對照組細胞無顯著性差異,表明HCMV IE1基因能顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞凋亡;Transwell實驗分析轉染HCMV IE1組、空質(zhì)粒對照組和細胞對照組細胞的遷移和侵襲能力發(fā)現(xiàn)轉染HCMV IE1基因后U251細胞的遷移和侵襲能力較空質(zhì)粒對照組和細胞對照組顯著增強(P0.01),而空質(zhì)粒對照組和細胞對照組細胞無顯著性差異;劃痕實驗結果顯示轉染HCMV-IE1后U251細胞株遷移能力顯著增強(P0.01)。結論HCMV感染與神經(jīng)膠質(zhì)瘤存在相關性,HCMV可能通過IE1等多種分子信號途徑參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4
【圖文】：

圖 1 CMV pp65 抗原血癥檢測結果A：陽性對照玻片的檢出結果；B：陰性 CMV pp65 檢測結果Fig 1. The result of CMV pp65 antigenic testA: Positive control test results of slides; B: Negative test results of CMV pp652.2 血清抗 HCMV IgG、IgM 抗體檢測結果在 39 例膠質(zhì)瘤患者中，有 36 例（92.3%）抗 HCMV IgG 抗體陽性，7 例（17.9%）抗 HCMV IgM 抗體陽性（表 1 和表 2）；對照組 9 例 IgG 抗體及 IgM 抗體均陰性；實驗組 IgG 抗體（χ2=33.2，P<0.01）檢出率明顯高于對照組；兩組間 IgM 抗體檢出率無顯著性差異（χ2=1.89，P>0.05）。膠質(zhì)瘤組織病毒 DNA 拷貝數(shù)和外周血中抗人巨細胞病毒 IgM 陽性程度呈顯著正相關（r=0.76，p<0.01）。HCMV IE72 和 pp65抗原均能夠在 HCMV IgM 陽性的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中檢出。在 3 例 HCMV IgG 陰性

圖 2 膠質(zhì)瘤及外周血患者中 HCMV DNA 水平檢測結果A、B：在 25 例膠質(zhì)瘤組織和 20 例外周血標本中檢測到 HCMV DNA；C：UL55 PCR 產(chǎn)物的部分測序結果Fig 2. Nested PCR demonstrates that HCMV DNA UL55 gene exists in tumor tissue andperipheral blood of glioma patients.A and B: HCMV DNA was detected in 25 glioma tissues and 20 peripheral blood samples. C:partial sequencing results of UL55 PCR products2.2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和外周血中 HCMV DNA 載量通過熒光定量 PCR 擴增 UL123 外顯子 4 的 100 bp 區(qū)域來確定神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織及外周血中 HCMV DNA 的載量。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中每 500 ng 的總 DNA 平均log10 HCMV DNA 拷貝數(shù)為 3.75±1.60，在外周血中每 500 ng 的總 DNA 平均 log10

安徽醫(yī)科大學博士學位論文NA 拷貝數(shù)為 2.88±1.209，瘤組織 HCMV DNA 含量明顯高001）（見圖 3）；對照組分別為(1.66±0.19)、(1.54±0.12)；實驗P<0.01）在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和外周血中 HCMV DNA 拷貝數(shù)均染時 HCMV DNA 拷貝數(shù)（平均 log10 HCMV DNA 拷貝數(shù)為 PCR 共 25 例樣本 HCMV DNA 結果陽性，對照組均為陰性量結果（log10 HCMV DNA 拷貝數(shù)為 4.76±1.05）顯著高于陰量（1.96±0.18）（P<0.01）。

【參考文獻】

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1 施浩強;葛俊;唐亮;杜俊華;張濤;王明麗;于德新;;HCMV活動性感染與尿路上皮癌的相關性研究[J];安徽醫(yī)科大學學報;2013年01期

2 劉玲玲;方峰;;IE72在人巨細胞病毒感染中的作用[J];國際病毒學雜志;2011年03期

本文編號：2779945