【摘要】：研究目的:惡性膠質(zhì)瘤(malignant glioma,MG)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)惡性腫瘤,具有異常增殖、廣泛浸潤、高度異質(zhì)、放化療抵抗等特點。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM)是最具典型特征的惡性膠質(zhì)瘤。越來越多的證據(jù)支持癌癥是代謝紊亂性疾病,存在特異的代謝重構(gòu)。目前現(xiàn)有的治療手段近二十年來未能明顯改善GBM的生存期,僅有限推進(jìn),免疫治療帶來了希望。有氧糖酵解是GBM代謝改變的一個顯著特征,同時也是免疫細(xì)胞快速反應(yīng)所必須。腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞的代謝競爭為尋求治療靶點提供了機(jī)會。丙酮酸激酶M2型(Pyruvate Kinase M2,PKM2)在有氧糖酵解中發(fā)揮關(guān)鍵作用,是細(xì)胞糖酵解途徑末端的關(guān)鍵限速酶。本研究探究PKM2在膠質(zhì)瘤中的分布和表達(dá)規(guī)律,在腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲中所起的作用。抑制腫瘤細(xì)胞的PKM2表達(dá)對腫瘤生長和原位種植腫瘤荷瘤鼠生存期的影響,能否減緩腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制狀態(tài),本課題進(jìn)行了初步的研究。研究方法:采用生物信息學(xué)的分析方法,通過MERAV、Oncomine、Murat Brain、Sun Brian數(shù)據(jù)庫,對人類正常各部位組織和不同腫瘤組織中PKM2的表達(dá)進(jìn)行對比分析,并著重分析對照腦組織和各級別膠質(zhì)瘤中PKM2的表達(dá)差異。進(jìn)一步利用TCGA和CGGA數(shù)據(jù)庫對不同病理級別中PKM2的轉(zhuǎn)錄及相關(guān)通路的關(guān)鍵分子進(jìn)行分析,總結(jié)其特點。在TCGA數(shù)據(jù)庫,分析GBM中各種免疫細(xì)胞的存在與患者預(yù)后的關(guān)系。細(xì)胞熒光、免疫組織化學(xué)染色、免疫熒光、Western blot實驗檢測不同級別腦膠質(zhì)瘤腫瘤切除標(biāo)本、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中PKM2的表達(dá)情況。構(gòu)建GL261細(xì)胞系C57BL/6小鼠鼠腦原位種植模型及皮下種植模型,敲低PKM2對腫瘤生長和顱內(nèi)荷瘤鼠生存期的影響,比較對照組和敲低組中腫瘤組織表達(dá)CD163、PD-L1的差異。研究結(jié)果:PKM2在常見的腫瘤中高表達(dá),在快速反應(yīng)的免疫細(xì)胞也表達(dá)。在TCGA數(shù)據(jù)庫中,PKM2的表達(dá)和膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后相關(guān)。PKM2表達(dá)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞系、膠質(zhì)瘤腫瘤組織。PKM2在各級別膠質(zhì)瘤中均有所表達(dá),隨著級別增高,表達(dá)增強(qiáng)。敲低PKM2的表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,但卻增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力,可能的機(jī)制是氧化磷酸化增強(qiáng),啟動了下游骨架蛋白的表達(dá)。GL261細(xì)胞系C57BL/6小鼠鼠腦原位種植模型顯示,敲低PKM2能抑制腫瘤的生長,延長荷瘤鼠的生存期。相關(guān)于對照組,PKM2敲低組腫瘤標(biāo)本中CD163、PD-L1的表達(dá)減少,推測由于乳酸的產(chǎn)生減少,使得腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞M2亞型細(xì)胞生成的減少,PD-L1的表達(dá)減弱能減緩能對T殺傷細(xì)胞的抑制,從而能解除腫瘤微環(huán)境中部分免疫抑制作用。結(jié)論:PKM2是有氧糖酵解的關(guān)鍵限速酶,在惡性膠質(zhì)瘤中高表達(dá),隨著級別升高,表達(dá)增強(qiáng)。PKM2的異常表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展,抑制PKM2的表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞增殖,但促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。動物模型實驗提示抑制PKM2能減緩腫瘤的生長,延長顱內(nèi)荷瘤鼠的生存期。抑制PKM2后,腫瘤組織中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞M2亞型減少,腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1減少,能減緩微環(huán)境中的免疫抑制狀態(tài),涉及的復(fù)雜機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R739.4
【圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文圖 1.2 TCGA 和 CGGA 數(shù)據(jù)庫顯示 PKM2 在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況及與預(yù)后的關(guān)系。PKM2 在高級別膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，在間質(zhì)型中表達(dá)相對其他類型升高。PKM2 的表達(dá)升高，生存期相對縮短，提示與預(yù)后相關(guān)。1.2.3 數(shù)據(jù)庫組織芯片提示 PKM2 的表達(dá)情況數(shù)據(jù)庫組織芯片免疫組化化學(xué)染色，提示低級別膠質(zhì)瘤和高級別膠質(zhì)瘤均表達(dá) PKM2 蛋白，但高級別膠質(zhì)瘤異常高表達(dá) PKM2 蛋白，提示與級別有相關(guān)性（如圖 1.3）。

圖 1.4 PKM2 在單中心收集的各級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)特征。PKM2 在低級別膠質(zhì)瘤中表達(dá)較弱，高級別膠質(zhì)瘤中表達(dá)增強(qiáng)，隨著級別的升高，表達(dá)增強(qiáng)（圖×200）。1.2.5 PKM2 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)規(guī)律對常見的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系進(jìn)行了 PKM2 的免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn) GL261、U87、U251及 LN229 中均表達(dá) PKM2，熒光強(qiáng)度較高，各細(xì)胞系間的表達(dá)無明顯差異，以 GL261細(xì)胞為例（如圖 1.5）。

圖 1.4 PKM2 在單中心收集的各級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)特征。PKM2 在低級別膠質(zhì)瘤中表達(dá)較弱，高級別膠質(zhì)瘤中表達(dá)增強(qiáng)，隨著級別的升高，表達(dá)增強(qiáng)（圖×200）1.2.5 PKM2 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)規(guī)律對常見的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系進(jìn)行了 PKM2 的免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn) GL261、U87、U25及 LN229 中均表達(dá) PKM2，熒光強(qiáng)度較高，各細(xì)胞系間的表達(dá)無明顯差異，以 GL26細(xì)胞為例（如圖 1.5）。

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本文編號：2773840