【摘要】：目的:探討硫辛酸(Lipoic Acid,LA)能否通過抑制凋亡誘導(dǎo)因子(Apoptosis-inducing factor,AIF)介導(dǎo)的非Caspase依賴性凋亡通路對多巴胺能神經(jīng)元起保護作用,為臨床上治療帕金森病(Parkinson's disease,PD)提供相關(guān)實驗依據(jù)。方法:(1).通過6-羥多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)誘導(dǎo)PC12細胞損傷建立PD細胞模型,給予LA(75μmol/L)干預(yù);通過CCK-8法檢測細胞活力、熒光探針DCFH-DA檢測活性氧水平、熒光探針JC-1檢測線粒體膜電位、流式檢測凋亡;通過Western blot檢測酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)表達。(2).健康雄性SD大鼠,隨機分為6-OHDA組(n=40)和假手術(shù)組(n=15),向6-OHDA組SD大鼠右側(cè)紋狀體注射6-OHDA,假手術(shù)組注射等體積的生理鹽水做為對照。術(shù)后第四周通過阿撲嗎啡(Apomorphine,APO)旋轉(zhuǎn)實驗篩選出成功的PD大鼠模型大鼠(向健側(cè)旋轉(zhuǎn)圈速2 r/min);隨機將成功的PD大鼠模型分為PD模型組和LA干預(yù)組;術(shù)后第五周起,LA干預(yù)組給予硫辛酸(50 mg/kg/d)干預(yù)14 d。采用旋轉(zhuǎn)實驗和圓筒實驗,檢測PD模型大鼠行為學(xué)變化;采用免疫組化檢測大鼠損毀側(cè)神經(jīng)元特異性標志物神經(jīng)核抗原(Neuron-specific nuclear antigen,NeuN)的和多巴胺能神經(jīng)元特異性標志物TH的表達,檢測LA對6-OHDA損毀的大鼠黑質(zhì)區(qū)域神經(jīng)元和DA能神經(jīng)元的影響。(3).在PD細胞模型和大鼠模型中,通過Western blot檢測LA對6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型線粒體和細胞核中AIF表達量的影響;通過激光共聚焦顯微鏡觀察LA對6-OHDA誘導(dǎo)PD模型中AIF定位的影響。結(jié)果:(1).體外實驗結(jié)果顯示:75μmol/L的6-OHDA處理PC12細胞18 h后細胞活力下降至65.28±4.13%;而經(jīng)10μmol/L LA預(yù)處理后加入75μmol/L的6-OHDA共培養(yǎng)18h,PC12細胞的細胞活力升至80.00±5.41%。與正常對照組相比;PC12細胞在6-OHDA的誘導(dǎo)下細胞內(nèi)活性氧含量顯著升高(P0.05),細胞線粒體膜電位顯著降低(P0.05),細胞凋亡率顯著升高(P0.05),TH表達量顯著降低(P0.05)。與6-OHDA組相比,LA的預(yù)處理后再加入6-OHDA共培養(yǎng);PC12細胞活性氧含量顯著降低(P0.05),線粒體膜電位顯著升高(P0.05),細胞凋亡率顯著降低(P0.05),TH表達量顯著升高(P0.05)。(2).體內(nèi)實驗結(jié)果顯示:與假手術(shù)組相比;PD模型組和LA干預(yù)組在APO的誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)實驗中向健側(cè)旋轉(zhuǎn)圈顯著升高(P0.05),筒實驗中左前肢使用頻率顯著下降(P0.05);損毀側(cè)黑質(zhì)區(qū)NueN和TH陽性細胞數(shù)顯著降低(P0.05)。與PD模型組相比;LA干預(yù)組在旋轉(zhuǎn)實驗中向健側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)顯著下降(P0.05),在圓筒實驗中左前肢使用頻率顯著升高(P0.05);損毀側(cè)黑質(zhì)區(qū)NueN和TH陽性細胞數(shù)顯著升高(P0.05)。(3)體/內(nèi)外實驗結(jié)果均顯示:與對照組相比;PC12細胞或大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元,在6-OHDA的誘導(dǎo)下,線粒體中AIF表達量顯著降低(P0.05),而核內(nèi)AIF表達量顯著升高(P0.05),且AIF與細胞核出現(xiàn)共定位現(xiàn)象。與PD模型組相比;經(jīng)LA干預(yù)后,線粒體中AIF表達量顯著升高(P0.05),而核內(nèi)AIF表達量顯著降低(P0.05)。結(jié)論:(1).LA通過抑制活性氧(Reactive oxygensPecies,ROS)的產(chǎn)生、線粒體功能障礙和凋亡對6-OHDA誘導(dǎo)損傷的PC12細胞起保護作用。(2).LA緩解PD模型大鼠行為學(xué)改變。(3).LA減緩6-OHDA誘導(dǎo)下PD模型大鼠中腦黑質(zhì)神經(jīng)元和多巴胺能神經(jīng)元的丟失。(4).AIF介導(dǎo)的非Caspase依賴性凋亡通路參與了6-OHDA誘的多巴胺能神經(jīng)元的丟失過程。(5).LA可以通過抑制黑質(zhì)區(qū)AIF介導(dǎo)的非Caspase依賴性凋亡通路而保護多巴胺能神經(jīng)元。
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R742.5
【圖文】：

結(jié)果以 ±s 表示，n = 3，與正常對照組（Ctrl 組）相比，#P< 0.05；與 PD 模型組（6-OHD組）相比，*P< 0.05。圖 2-13 注射側(cè)黑質(zhì)區(qū)域線粒體與細胞核中 AIF 表達量Fig. 2-13Western blot analyses of AIF Protein from SNPc of lesioned hemisphere

：圖中箭頭所指表示 AIF 核轉(zhuǎn)移的神經(jīng)元；標尺：20μm。圖 2-14 注射側(cè)黑質(zhì)區(qū)域 Confocal 結(jié)果圖Fig 2-14Confocal microscoPe images showing the AIF translocation into the nucleus

【參考文獻】

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本文編號：2767360