【摘要】：第一部分CXCR7對海馬齒狀回顆粒細(xì)胞樹突棘與突觸可塑性的調(diào)節(jié)作用目的:主要探討CXCR7對海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)顆粒細(xì)胞樹突棘與突觸可塑性的影響。方法:1.通過免疫熒光技術(shù)檢測CXCR7在C57BL/6小鼠海馬DG區(qū)的表達(dá)與分布。2.構(gòu)建攜帶有CXCR7-shRNA與CXCR7-過表達(dá)基因片段的腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV);將AAV定點注射至C57BL/6小鼠海馬DG區(qū),擬干預(yù)CXCR7在DG區(qū)的表達(dá)。通過免疫熒光與免疫印跡技術(shù)驗證CXCR7的干預(yù)效果。3.高爾基染色檢測DG區(qū)顆粒細(xì)胞頂樹突樹突棘的數(shù)目與形態(tài)。4.透射電鏡檢測DG區(qū)興奮性突觸(excitatory synapses,ESs)的數(shù)目與結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果:1.在小鼠海馬DG區(qū)中,CXCR7在顆粒層有較為豐富的表達(dá),且在顆粒層與NeuN+細(xì)胞共定位。2.免疫熒光結(jié)果提示AAV可以成功地轉(zhuǎn)染至DG區(qū)顆粒細(xì)胞;免疫熒光與免疫印跡結(jié)果提示CXCR7-shRNA顯著地抑制了CXCR7的表達(dá);CXCR7-過表達(dá)顯著地促進(jìn)了CXCR7的表達(dá)。3.敲減CXCR7可以抑制樹突棘的生長與成熟,即樹突棘數(shù)目的減少與mushroom樹突棘的比例降低;過表達(dá)CXCR7則促進(jìn)了樹突棘生長與成熟,即樹突棘數(shù)目的增加與mushroom樹突棘的比例升高;通過rescue實驗(CXCR7-過表達(dá))明顯地減弱了CXCR7-shRNA對樹突棘生長與成熟的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。4.敲減CXCR7可以減少ESs的數(shù)目,縮短突觸后致密物(postsynaptic density,PSD)的長度與厚度;過表達(dá)CXCR7則可增加ESs的數(shù)目,增加PSD的長度與厚度;rescue實驗則明顯減弱了CXCR7-shRNA對突觸數(shù)目、PSD長度與厚度的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。結(jié)論:CXCR7的表達(dá)變化可引起樹突棘的生長與形態(tài)、ESs的數(shù)目與結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。第二部分CXCR7對海馬齒狀回顆粒細(xì)胞興奮性突觸傳遞功能的調(diào)節(jié)作用目的:第一部分研究發(fā)現(xiàn)CXCR7的表達(dá)變化引起了DG區(qū)顆粒細(xì)胞樹突棘與ESs的數(shù)目與結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。因此,我們推測CXCR7對顆粒細(xì)胞的興奮性突觸傳遞具有調(diào)節(jié)作用。本部分將重點探討CXCR7對海馬DG區(qū)顆粒細(xì)胞興奮性突觸傳遞功能的調(diào)節(jié)作用。方法:1.AAV定點注射至海馬DG區(qū),干預(yù)CXCR7在DG區(qū)的表達(dá)。2.通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測顆粒細(xì)胞mEPSCs與PP evoked EPSCs(eEPSCs)的變化。3.通過免疫印跡技術(shù)檢測NR2A與NR2B的表達(dá)情況。結(jié)果:1.敲減CXCR7減低了NMDAR mEPSCs的頻率與波幅;過表達(dá)CXCR7則增高了NMDAR mEPSCs的頻率與波幅;rescue實驗明顯減弱了CXCR7-shRNA對NMDAR mEPSCs的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。CXCR7的敲減與過表達(dá)對AMPAR mEPSCs的頻率與波幅均無顯著影響。2.敲減CXCR7減少了NMDAR eEPSCs的波幅;過表達(dá)CXCR7則增加了NMDAR eEPSCs的波幅;rescue實驗部分逆轉(zhuǎn)了CXCR7-shRNA對NMDAR eEPSCs的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。CXCR7的敲減與過表達(dá)對AMPAR eEPSCs無顯著影響。3.敲減CXCR7減少了NR2A eEPSCs的波幅;過表達(dá)CXCR7則可以增加了NR2A eEPSCs的波幅;rescue實驗部分逆轉(zhuǎn)了CXCR7-shRNA對NR2A eEPSCs的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。CXCR7的敲減與過表達(dá)對NR2B eEPSCs無顯著影響。4.敲減CXCR7減少了細(xì)胞膜NR2A的表達(dá)水平,對總NR2A的表達(dá)水平無顯著影響;過表達(dá)CXCR7增加了細(xì)胞膜NR2A的表達(dá)水平,對總NR2A的表達(dá)水平仍無顯著影響;rescue實驗減弱了CXCR7-shRNA對細(xì)胞膜NR2A表達(dá)水平的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。CXCR7的敲減與過表達(dá)對NR2B膜蛋白與總蛋白的表達(dá)水平均無顯著影響。結(jié)論:CXCR7促進(jìn)了顆粒細(xì)胞NMDAR所介導(dǎo)的PP-evoekd的興奮性突觸傳遞活動,其主要影響NR2A所介導(dǎo)的突觸傳遞活動。CXCR7可能通過促進(jìn)細(xì)胞膜上NR2A的表達(dá),進(jìn)而增強NR2A所介導(dǎo)的興奮性突觸傳遞活動。第三部分CXCR7通過激活ERK1/2促進(jìn)NR2A所介導(dǎo)的興奮性突觸傳遞活動目的:既往研究提示CXCR7在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)中通過ERK1/2信號通路來發(fā)揮作用。因此,我們推測CXCR7可能也通過ERK1/2信號通路來調(diào)節(jié)NR2A所介導(dǎo)的興奮性突觸傳遞活動。本部分重點探討CXCR7是否通過ERK1/2促進(jìn)NR2A所介導(dǎo)的興奮性突觸傳遞活動。方法:1.AAV-CXCR7-過表達(dá)定點注射至海馬DG區(qū),促進(jìn)CXCR7在DG區(qū)的表達(dá)。2.腹腔注射ERK1/2磷酸化抑制劑SL327(50mg/kg),抑制小鼠腦組織中ERK1/2的磷酸化水平。3.通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測顆粒細(xì)胞PP-evoekd NR2A eEPSCs的變化。4.通過免疫印跡技術(shù)檢測ERK1/2磷酸化水平與NR2A的表達(dá)情況。結(jié)果:1.CXCR7的表達(dá)水平與ERK1/2的磷酸化水平呈正相關(guān):敲減CXCR7下調(diào)了ERK1/2的磷酸化水平;過表達(dá)CXCR7則上調(diào)了ERK1/2的磷酸化水平;rescue實驗減弱了CXCR7-shRNA對ERK1/2磷酸化水平的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。2.SL327顯著減弱了CXCR7對ERK1/2磷酸化水平的上調(diào)作用。3.SL327顯著減弱了過表達(dá)CXCR7對細(xì)胞膜NR2A表達(dá)的正性調(diào)節(jié)作用,提示CXCR7通過ERK1/2促進(jìn)細(xì)胞膜NR2A的表達(dá)。4.SL327顯著減弱了過表達(dá)CXCR7對PP-evoekd NR2A eEPSCs的正性調(diào)節(jié)作用,提示CXCR7通過ERK1/2促進(jìn)NR2A所介導(dǎo)的興奮性突觸傳遞活動。結(jié)論:CXCR7通過激活ERK1/2促進(jìn)NR2A所介導(dǎo)的興奮性突觸傳遞活動。第四部分CXCR7對癲癇發(fā)作易感性的影響目的:CXCR7對海馬顆粒細(xì)胞興奮性突觸傳遞活動的影響提示其可能會影響癲癇發(fā)作易感性。因此,本節(jié)重點探討CXCR7對癲癇發(fā)作易感性的影響。方法:1.收集顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy,TLE)患者與對照組患者的腦組織。2.通過免疫印跡技術(shù)與免疫熒光技術(shù)檢測CXCR7的表達(dá)情況。3.AAV定點注射至海馬的DG區(qū),干預(yù)CXCR7在DG區(qū)的表達(dá)。4.腹腔注射ERK1/2磷酸化抑制劑SL327(50mg/kg),抑制ERK1/2的磷酸化水平。5.將局部場電位(local field potential,LFP)的記錄電極植入海馬,構(gòu)建海人酸(kainic acid,KA)小鼠癲癇模型,記錄并分析癲癇行為學(xué)與腦電的變化。結(jié)果:1.與對照組相比,CXCR7在KA小鼠癲癇模型海馬組織中的表達(dá)水平上調(diào)。2.本研究共納入9名對照組患者與9名TLE患者。與對照組患者相比,CXCR7在TLE患者腦組織中的表達(dá)水平上調(diào)。3.在KA小鼠癲癇模型中,敲減CXCR7可延長癲癇自發(fā)發(fā)作(spontaneous recurrent seizure,SRSs)潛伏期,減少SRSs次數(shù),降低4-5級SRSs的比例,而過表達(dá)CXCR7則縮短SRSs潛伏期,增加SRSs次數(shù),提高4-5級SRSs的比例。4.SL327減弱了過表達(dá)CXCR7對SRSs的正性調(diào)節(jié)作用。結(jié)論:CXCR7可提高癲癇發(fā)作易感性。抑制ERK1/2的磷酸化水平可以減弱過表達(dá)CXCR7對癲癇發(fā)作易感性的促進(jìn)作用,提示CXCR7通過ERK1/2來調(diào)節(jié)癲癇發(fā)作易感性。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R742.1
【圖文】：

圖 1-2. AAV 在小鼠海馬 DG 區(qū)的轉(zhuǎn)染效果：（A）AAV-GFP（綠色）被準(zhǔn)確地注射到海馬DG 區(qū)（白色箭頭可見注射針痕跡），scale bar = 200μm；（B）AAV-GFP（綠色）廣泛地轉(zhuǎn)染至 DG 區(qū)顆粒層，scale bar = 100μm；（C）AAV-GFP（綠色）與 CXCR7（紅色）、MAP2（紫色）陽性染色的細(xì)胞存在共定位（白色箭頭），提示 AAV 成功轉(zhuǎn)染至顆粒細(xì)胞。upper scalebar = 100μm，lower scale bar = 20μm.Figure 1-2. AAV with green fluorescent protein (GFP) in the hippocampal DG. (A) AAV wassuccessfully injected in DG, scale bar = 200μm. (B) GFP positive cells (green) were widelydistributed in DG, scale bar = 100μm. (C) AAV-GFP (green) co-expression was observed inCXCR7-positive cell (red), MAP2-positive neurons (purple), upper scale bar = 100μm, lowerscale bar = 20μm.

圖 1-3. CXCR7 在干預(yù)后的表達(dá)變化：（A）AAV 注射后第 4 周時，各組間 DG 區(qū) CXCR7 熒光強度的差異（紅色）以及各組間 MFI 的差異（右下統(tǒng)計圖），scale bar = 100μm，n=5；（B-C）WB 檢測 AAV 注射后第 4 周（B）與第 9 周（C）時，CXCR7 在各組間的表達(dá)差異, n=5. One-wayANOVA，*p<0.05，**p<0.01。Figure 1-3. Expression of CXCR7 after AAV injection. (A) Immunofluorescence analysis: themean fluorescent intensity (MFI) of CXCR7 observed in DG at week 4 after AAV injection,n=5, scale bar = 100μm. (B-C) WB analysis: the expression level of CXCR7 at week 4 (B) andat week 9 (C) after AAV injection, n=5. One-way ANOVA,*p < 0.05, **p< 0.01.2.3 CXCR7 對 DG 區(qū)顆粒細(xì)胞樹突棘的調(diào)節(jié)作用本課題組通過高爾基染色檢測各組間樹突棘數(shù)目與形態(tài)的差異：顆粒細(xì)胞的頂樹突伸入 DG 區(qū)分子層，分子層由內(nèi)向外依次分為內(nèi)、中、外分子層，其中外、

38圖 1-5. CXCR7 的表達(dá)變化對 DG 區(qū) ESs，SVs，以及 PSD 長度及厚度的影響。（A）各組 E的代表圖，比例尺=200 nm。（B）各組 ESs 數(shù)目的統(tǒng)計分析（每 25μm2），n=3。（C）各組SVs 數(shù)目（單個）的統(tǒng)計分析，n=3。（D）各組間 PSD 長度的分析，n=3。（E）各組間 PS厚度的分析，n=3。ESs 的統(tǒng)計分析：one-way ANOVA；SVs 的數(shù)目、PSD 長度與厚度的分析：Kruskal-Wallis 檢驗；*p<0.05, **p<0.01。Figure 1-5. The quantitative analysis of ESs, SVs, PSD length and thickness. (A) Threpresentative electron micrographs of ESs, scale bar = 200 nm. (B) The statistical analysis the density of ESs, n=3 (the number of per 25μm2); (C) The quantitative analysis of th

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本文編號：2763601