【摘要】：目的研究Per2基因過表達(dá)對(duì)于U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞放療敏感性的影響。方法1.應(yīng)用無血清的培養(yǎng)基(在其中添加生長因子bFGF、生長因子rhEGF、B27試劑和N2添加劑)和懸浮培養(yǎng)法誘導(dǎo)U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,然后用過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,利用嘌呤霉素對(duì)轉(zhuǎn)染慢病毒的細(xì)胞進(jìn)行篩選,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和蛋白質(zhì)印記法檢測(cè)過表達(dá)組、空載體組和正常組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞內(nèi)Per2基因表達(dá)情況。3.給予8mV 100cGy X線照射三組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,并分別于24h,48h后,應(yīng)用蛋白質(zhì)印記法檢測(cè)各組細(xì)胞γH2AX蛋白表達(dá)情況。4.給予8mV 100cGy X線照射三組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,并分別于24h,48h后,應(yīng)用Annexin V-PE/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果1.U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在MOI值為17的條件下,細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率約為90%,隨著MOI值的增加,轉(zhuǎn)染效率沒有明顯變化。2.用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和蛋白質(zhì)印記法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)組干細(xì)胞內(nèi)Per2基因表達(dá)升高,明顯高于其他兩組細(xì)胞(P0.05),而空載體細(xì)胞組和正常細(xì)胞組Per2基因的表達(dá)情況無明顯差異(P0.05)。3.給予三組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞X線照射24h,48h,過表達(dá)細(xì)胞組干細(xì)胞的γH2AX蛋白表達(dá)量均高于其他兩組細(xì)胞(P0.05),而空載體組細(xì)胞和空白組細(xì)胞γH2AX蛋白表達(dá)量無明顯差異(P0.05),并且隨著時(shí)間增加,各組細(xì)胞γH2AX蛋白表達(dá)量均有所上升4.給予三組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞X線照射24h,48h,過表達(dá)組干細(xì)胞在24h和48h的細(xì)胞凋亡率分別為(45.3±0.75)%和(51±0.82)%,空載體組細(xì)胞在24h和48h的細(xì)胞凋亡率分別為(25±0.54)%和(29.8±0.49)%,空白組細(xì)胞在24h和48h的細(xì)胞凋亡率在24h和48h為(22.1±0.48)%和(26.9±0.50)%,過表達(dá)組干細(xì)胞細(xì)胞凋亡率明顯高于空載體組和空白組細(xì)胞(P0.05),而空載體組細(xì)胞和空白組細(xì)胞之間細(xì)胞凋亡率沒有明顯差異(P0.05),并且隨著放療后的時(shí)間延長,三組細(xì)胞的凋亡情況隨著時(shí)間增加而上升。結(jié)論1.使用Per2基因過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞成功得到Per2基因穩(wěn)定過表達(dá)的U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞株。2.Per2基因過表達(dá)時(shí),增加了U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在接受放療后DNA損傷標(biāo)志物γH2AX蛋白的表達(dá)量,明顯促進(jìn)細(xì)胞DNA的損傷,導(dǎo)致細(xì)胞接受放療后細(xì)胞凋亡情況增加,并且隨著時(shí)間延長,細(xì)胞的DNA損傷情況和細(xì)胞凋亡情況也隨之上升3.Per2基因過表達(dá)時(shí),可明顯增強(qiáng)U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)于放療的敏感性。
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R739.41
【圖文】：

19圖 1. 圖 A 到圖 H 分別為 MOI 值為 1、5、7、10、12、15、17、20 的條件下，慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)熒光表達(dá)情況。從圖中可以發(fā)現(xiàn)隨著 MOI 值的不斷上升，細(xì)胞熒光亮度也在不斷增強(qiáng)，在 MOI 值為 17 時(shí)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到 90％，繼續(xù)增大 MOI 值后，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率無明顯增強(qiáng)。2. 慢病毒轉(zhuǎn)染后 Real-time PCR 檢測(cè)干細(xì)胞內(nèi) Per2 基因表達(dá)情況

圖 4. Wetern  blot 檢測(cè)三組細(xì)胞放療后γH2AX 蛋白表達(dá)圖 A：三組細(xì)胞放療后 24hγH2AX 蛋白表達(dá)情況，圖 B：三組細(xì)胞放療后 48hγH2AX 蛋白表達(dá)情況。 細(xì)胞分組分別為空載體組干細(xì)胞（LV-NC）、過表達(dá)組干細(xì)胞（LV-OE）和空白組干細(xì)胞（Normal）5. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞放療后的凋亡情況使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三組細(xì)胞凋亡情況后可見（圖 4），過表達(dá)組干細(xì)胞在 24h和 48h 的細(xì)胞凋亡率分別為（45.3±0.75）％和（51±0.82）％，空載體組細(xì)胞在 24h 和 48h 的細(xì)胞凋亡率分別為（25±0.54）％和（29.8±0.49）％，空白組細(xì)胞在 24h 和 48h 的細(xì)胞凋亡率在 24h 和 48h 為（22.1±0.48）％和（26.9±0.50）％，過表達(dá)組干細(xì)胞細(xì)胞凋亡率明顯高于空載體組和空白組細(xì)胞（P<0.05），而空載體組細(xì)胞和空白組細(xì)胞之間細(xì)胞凋亡率沒有明顯差異（P>0.05），并且隨

寧夏醫(yī)科大學(xué) 結(jié)果24圖5. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞放療后的凋亡情況圖A：三組細(xì)胞的24h細(xì)胞凋亡情況的流式圖，圖B：48h細(xì)胞凋亡情況的流式圖，圖C：24h細(xì)胞凋亡率的柱狀統(tǒng)計(jì)圖，圖D：48h細(xì)胞凋亡率的柱狀統(tǒng)計(jì)圖。24h48hBCD

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本文編號(hào)：2761097