【摘要】：研究背景卒中被認為是世界各國主要的公共衛(wèi)生問題之一,占據(jù)發(fā)達國家健康支出費用第三位,為成人常見的致死、致殘原因,每16例死亡病人中就有1例死于中風。在所有卒中事件大部分為缺血性卒中,出血性卒中僅占15%左右。目前,我國流行病學(xué)統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明,每年死于急性缺血性腦卒中的人數(shù)已經(jīng)超過腫瘤和心血管疾病,躍居第1位,成為首位國民致死原因,且仍以每年9%的速率增長。即使存活下來,仍需要長期昂貴的康復(fù)治療。腦卒中存活者約3/4喪失勞動能力,其中重度致殘者約占40%,導(dǎo)致極大的社會和經(jīng)濟負擔。目前,循證醫(yī)學(xué)已證實早期溶栓及介入治療的有效性,但由于其狹窄的治療時間窗、昂貴的費用及較高技術(shù)水平,由于狹窄的治療窗,僅一小部分患者從靜脈溶栓后血運重建獲益。迄今為止,臨床尚缺乏有效的腦梗死后腦保護治療策略。腦梗死病理生理機制復(fù)雜,腦梗死后多種因素導(dǎo)致細胞死亡信號通路啟動,因此靶向腦缺血后細胞死亡通路的激活進行了多種研究,靶向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,進行神經(jīng)保護藥物的研發(fā),雖然動物實驗取得了可喜的成績,然而臨床實驗未取得成功�？紤]到許多針對單一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為靶點的候選藥物研究的失敗,對缺血性腦損傷神經(jīng)保護的首選策略可能是同時阻斷神經(jīng)損傷的多個核心的關(guān)鍵途徑,包括與腦缺血病理過程有關(guān)的多細胞復(fù)雜活動和事件。同時阻斷腦損傷多個關(guān)鍵途徑是缺血性腦卒中的首選治療策略。細胞死亡信號和炎性反應(yīng)在腦缺血損傷中起重要作用。熱休克蛋白家族包含一組熱敏細胞應(yīng)激蛋白,它們最好的特征在于分子伴侶功能,尤其是伴隨熱應(yīng)激。在過去的幾十年的研究中,熱休克蛋白一直是研究的焦點。根據(jù)熱休克蛋白分子量、域保護和功能分為多個亞家族。小熱休克蛋白(sHSP),包括HSP27,廣泛表達于多種物種,單體分子量在15-42kDa之間。最近的實驗研究開始強調(diào)Hsp27在細胞應(yīng)激壓力中保護作用重要性。越來越多的證據(jù)表明Hsp27抑制細胞死亡信號,另外,Hsp27經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后修飾,導(dǎo)致不同的控制功能。HSP27差異表達表達于某些神經(jīng)元的亞型,其中高組成型表達主要限于脊髓神經(jīng)節(jié)中和腦干,基礎(chǔ)表達在小腦浦肯野纖維細胞的亞型。無論是作為組成型表達還是被誘導(dǎo)應(yīng)對細胞應(yīng)激,Hsp27在神經(jīng)元損傷時表達。已有充分的實驗證據(jù)表明,Hsp27具有在多種神經(jīng)疾病模型減少的神經(jīng)元損傷的功效,在神經(jīng)保護中扮演重要能動角色。雖然Hsp27在腦中的組成型表達水平較低,但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)若干應(yīng)激,如包括熱應(yīng)激,局部缺血和癲癇發(fā)作可誘導(dǎo)Hsp27的表達。免疫組化表明,Hsp27在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中表達量較多,僅在有限數(shù)量的神經(jīng)元細胞中表達。有研究報道,Hsp27經(jīng)單純皰疹病毒載體遞送到腦可以有效預(yù)防紅藻氨酸鹽誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡。過表達人類Hsp27可以有效降低紅藻氨酸誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬神經(jīng)元凋亡。腦缺血后,內(nèi)源性Hsp27表達增加主要在膠質(zhì)細胞。病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或基因過表達Hsp27顯著減少缺血性病變的面積。全長蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)HSP27能夠有效地降低沙鼠全腦缺血模型海馬CA1區(qū)損傷。凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK-1)是傳導(dǎo)細胞死亡信號的關(guān)鍵分子且在小膠質(zhì)細胞激活中起關(guān)鍵作用。許多研究發(fā)現(xiàn)Hsp27可直接抑制ASK1通過阻斷死亡信號而對腦缺血發(fā)揮保護作用。由于血腦屏障的存在,大分子蛋白藥物不易透過血腦屏障,且具有免疫原性,大大限制了其應(yīng)用。多肽類藥物近年來成為醫(yī)藥界研究的熱點,已經(jīng)多種肽類藥物廣泛應(yīng)用于腫瘤、炎癥、心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和免疫性疾病等。由于多肽類藥物具有整個蛋白的生物學(xué)功能,分子量小,易于人工合成,副作用低,因而更具有臨床研發(fā)價值。多肽類藥物研發(fā)的迅猛發(fā)展引起神經(jīng)科學(xué)工作者的重視,積極研發(fā)靶向中樞缺血性神經(jīng)損傷的保護多肽類藥物,已經(jīng)取得了一定的進展。依照國際藥學(xué)界劃分標準,蛋白質(zhì)類藥物:由大于100個氨基酸分子組成的藥物,如臨床常用藥物胰島素、干擾素等;多肽類藥物:100個以下的氨基酸組成的藥品,目前臨床應(yīng)用的多肽藥物共有80余種,涉及內(nèi)分泌、血管、腫瘤、泌尿、免疫等多個系統(tǒng)疾病的治療。與全長蛋白及化學(xué)藥物相比,短肽類藥物具有以下優(yōu)勢:(1)短肽的免疫原性更弱,潛在的副作用也就更少;(2)短肽具有更高的生物活性和特異性;(3)易于容易合成和提純;(4)在體內(nèi)具有較好的親和性,且藥物相互作用比較少。關(guān)于Hsp27模擬肽(HSP27MP)對腦梗死的保護作用尚未見相關(guān)研究報導(dǎo)。研究目的1.觀察HSP27MP靜脈給藥后,正常生理狀態(tài)及實驗性腦梗死,其在神經(jīng)元,小膠質(zhì)細胞,ASK1分子內(nèi)的分布。2.探討HSP27MP對實驗性腦梗死的保護作用。3.研究HSP27MP對實驗性腦梗死的保護作用機制。研究方法1.實驗動物SPF級雄性昆明種小鼠,體重25-35g,購至山東省動物實驗動物中心,動物許可證號:SCXK(京)2012-0001。實驗動物操作遵照泰山醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)研究中心腦科研究所《實驗動物使用和管理原則》。2.制作小鼠實驗性腦梗死模型局灶性皮質(zhì)缺血小鼠模型采用光化學(xué)法誘導(dǎo)皮質(zhì)微血管栓塞。小鼠采取5%異氟烷誘導(dǎo)麻醉,并以2%異氟烷維持麻醉。在手術(shù)過程中用恒溫毯保持直腸溫度在(37±0.5)�！�。經(jīng)股靜脈注入2%玫瑰紅(100mg/kg體重),給藥組注射玫瑰紅的同時,給予HSP27MP(或HSP27MP-FITC)(10mg/kg體重),注射過程不少于2分鐘。注射完畢后,即刻將小鼠固定于立體定位儀,調(diào)整定位儀參數(shù),前囪和后囪處于水平位置。常規(guī)手術(shù)區(qū)消毒備皮。經(jīng)顱頂正中線切開皮膚,長約1cm,鈍性分離皮下組織,徹底去除骨膜,充分暴露前囟、后囟、人字縫和矢狀縫。根據(jù)小鼠立體定向坐標圖譜,選取小鼠感覺運動皮層為光照區(qū)域,具體參數(shù)為:矢狀縫左側(cè)2mm、前囟2.4mm,冠狀縫后2mm。光源被放置盡可能貼近頭骨,使冷光源光導(dǎo)纖維探頭垂直貼近顱骨約1.5mm,經(jīng)完整露骨照射4分鐘。3.HSP27MP-FITC 腦內(nèi)示蹤HSP27MP-FITC給藥后24h,取材后冰凍切片,行NeuN、Iba-1和ASK-1免疫熒光染色,評估HSP27MP在腦內(nèi)的分布。4.局部腦血流量(regional cerebral blood flow,rCBF)測定于術(shù)后Oh和24h,麻醉小鼠后,剪開頭皮,充分暴露頭骨,采用2D多普勒激光血流測量儀檢測各組小鼠的rCBF。5.神經(jīng)功能評分24h后,取各組小鼠行Zealonga評分、平衡木實驗(beam balance test)、圓筒實驗(cylindertest)和足失誤實驗(foot-faulttest),評估神經(jīng)功能。6.TTC染色測定腦梗死體積于術(shù)后24h過量麻醉處死小鼠,取新鮮腦組織切片,置于1%的TTC溶液中染色,掃描儀掃描后,應(yīng)用ImageJ軟件測量腦梗死體積。7.伊文思藍(Evans Blue,EB)滲透法檢測血腦屏障(blood brain barrier,BBB)通透性術(shù)后23h,經(jīng)股靜脈注射2%EB(5ml/kg weight),循環(huán)1h后,經(jīng)心臟灌注50ml PBS后斷頭取腦,定性、定量評估BBB的通透性。干濕重法評估腦水腫。8.免疫熒光染色評估缺血半暗帶小膠質(zhì)細胞和激活的小膠質(zhì)細胞取材后,腦冰凍切片,行Iba-1和CD-68染色,評估小膠質(zhì)細胞及激活的小膠質(zhì)細胞的表達數(shù)量程度。9.免疫熒光染色評估神經(jīng)元凋亡取材后,腦冰凍切片,行NeuN+TUNEL免疫熒光染色,評估缺血半暗帶神經(jīng)元細胞凋亡。10.Western blot檢測腦梗死后缺血半暗帶ASK1和p-ASK1表達水平。研究結(jié)果:1.HSP27MP腦內(nèi)分布FITC標記的HSP27MP靜脈給藥24h后,采用激光共聚焦顯微鏡及熒光顯微鏡觀察HSP27MP在腦內(nèi)的分布。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在生理及實驗性腦梗死狀態(tài)下,HSP27MP均可穿過BBB,在腦內(nèi)彌漫性分布,可進入神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞,并可與靶分子ASK1共定位,且在腦梗死側(cè)聚集。2.HSP27MP對實驗性腦梗死的保護作用我們研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),HSP27MP可以有效降低腦梗死體積,改善腦梗死后早期神經(jīng)功能缺損,但未能改善rCBF。證實了 HSP27MP對實驗性腦梗死的保護作用。3.HSP27MP對實驗性腦梗死的保護作用機制我們采用EB滲透法檢測定性、定量檢測BBB的通透性,干濕重法評估腦水腫,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),HSP27MP可以有效保護腦梗死導(dǎo)致的BBB的破壞,減輕腦水腫。免疫熒光檢測結(jié)果表明,HSP27MP減少小膠質(zhì)細胞的激活,降低缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元凋亡。結(jié)論:1.HSP27MP靜脈給藥可以透過BBB進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。2.HSP27MP對實驗性腦梗死起到保護作用。3.HSP27MP通過保護BBB,減輕腦水腫,抑制小膠質(zhì)細胞的激活,減少神經(jīng)元的凋亡對實驗性腦梗死起到保護作用。研究背景蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)主要是由顱內(nèi)動脈瘤破裂所致的急性腦血管事件,約占所有腦卒中的5%-10%,在所有SAH患者中,猝死率高達20%,約50%的幸存者遺留認知障礙和慢性神經(jīng)功能衰退[1]。SAH及其并發(fā)癥是世界范圍內(nèi)成人致死致殘的主要原因之一[2]。盡管SAH的診斷和手術(shù)治療技術(shù)不斷進展,但有效的干預(yù)治療措施仍然有限,難以取得滿意的臨床效果。發(fā)現(xiàn)在過去的幾十年里,腦血管痙攣(cerebralvasospasm,CVS)和動脈瘤再出血被認為預(yù)后不良的主要決定因素,雖然眾多動物實驗研究發(fā)現(xiàn)許多藥物可以滅活致痙攣物質(zhì)或者阻斷動脈平滑肌收縮,但沒有發(fā)現(xiàn)任何一種藥物可以極大改善SAH患者的臨床結(jié)局[3]。Kusaka[4]等2004年報導(dǎo)SAH后早期腦損傷(early brain injury,EBI),定義為出血即刻至CVS的開始這一階段,指的是SAH后72h內(nèi)整個腦的急性損傷,包括氧化應(yīng)激,神經(jīng)炎癥,離子干擾和神經(jīng)炎癥等。其詳細機制仍未闡明,潛在的病理生理機制主要包括早期顱內(nèi)壓的升高,腦血流減少,腦含氧量的降低,腦灌注壓降低,神經(jīng)元凋亡,血腦屏障的破壞和腦水腫等[5]。眾多國內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)者們研究發(fā)現(xiàn)是SAH后死亡和致殘的主要原因[6],現(xiàn)在EBI被認為對SAH患者治療改進具有巨大潛力,可減弱一些長期的SAH后二次致命性腦損傷。因此,尋求SAH后EBI的治療新策略是神經(jīng)科學(xué)界亟待解決的一個難題。新近的眾多研究表明,許多炎癥成分導(dǎo)致動脈瘤破裂后腦損傷的進展,而小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有免疫活性的原位吞噬細胞,在神經(jīng)炎癥中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[7]。與小膠質(zhì)細胞類似,星形膠質(zhì)細胞能合成和分泌炎癥因子,如細胞因子和趨化因子�，F(xiàn)有的文獻表明,多種因素都與炎癥病變的發(fā)展相關(guān),SAH后,蛛網(wǎng)膜下腔的血紅蛋白刺激白細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞增殖,分泌的細胞因子導(dǎo)致腦損傷[8]。越來越多的研究證據(jù)表明神經(jīng)炎癥在EBI的發(fā)病機理中扮演重要角色,SAH后炎性因子的水平升高,參與了EBI的發(fā)生和發(fā)展[9,10],眾多研究結(jié)果凸顯了炎癥反應(yīng)是EBI的主要因素[11,12]。因此,尋求安全有效的抗炎藥物是改善SAH患者預(yù)后的潛在治療策略[13]。自19世紀70年代以來,磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)抑制劑一直是抗炎治療藥物的研究目標[14]。在許多免疫細胞中,PDE-4是第二信cAMP主要的降解酶,在大腦皮層和海馬均有表達。抑制PDE-4在炎癥扮演重要角色的神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷的動物模型中產(chǎn)生有益作用,如脊髓損傷[15]、創(chuàng)傷性腦損傷[16]、阿爾茨海默病[17]、重度抑郁癥[18]、多發(fā)性硬化癥[19]和缺血性腦卒中[20]。神經(jīng)科學(xué)家通過實驗研究發(fā)現(xiàn),西洛地唑,選擇性PDE3抑制劑,動物實驗研究發(fā)現(xiàn)可以減輕SAH后CVS[21]。令人鼓舞的是,一項臨床系統(tǒng)回顧和薈萃分析表明,西洛他唑可以顯著減少動脈瘤性SAH患者的癥狀性腦血管痙攣,嚴重的腦血管痙攣,腦血管痙攣相關(guān)的腦梗死和不良后果的發(fā)生率,且無顯著的不良反應(yīng),支持應(yīng)用到動脈瘤性SAH[22]。體外實驗研究證明,羅氟司特氮氧化物抑制多種細胞中的PDE-4,包括中性粒細胞,內(nèi)皮細胞,單核細胞/巨噬細胞,Cd4+和CD8+T細胞,平滑肌細胞[23]。體內(nèi)實驗研究證明羅氟司特可以減輕煙草煙霧誘導(dǎo)的肺部炎癥,肺血管重構(gòu)和高血壓[23]。羅氟司特具有腦滲透性,其在大腦中的濃度呈現(xiàn)劑量依賴性的方式增加[24,25],其非嘔吐劑量可以有效改善高血壓導(dǎo)致的嚙齒類動物學(xué)習、記憶和認知功能損害。本研究測試的假設(shè)羅氟司特減少大鼠SAH后促炎細胞因子、血腦屏障通透性和神經(jīng)細胞凋亡。研究目的1.研究羅氟司特對SAH后EBI是否有保護作用。2.研究羅氟司特對SAH后神經(jīng)炎癥的影響。3.探討羅氟司特對SAH早期CVS的影響。研究方法1.實驗動物12周齡雄性SPF級SD大鼠(體重250-350g)購自山東省實驗動物中心,飼養(yǎng)于泰山醫(yī)學(xué)院腦科研究所動物房,晝夜節(jié)律,自由飲食進水,符合山東省泰山醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)研究中心實驗動物管理規(guī)定。飼養(yǎng)一周后進行實驗,隨機分為Sham組,SAH組和SAH+羅氟司特組。2.SAH模型制作和給藥根據(jù)既往研究方法[26],采用改良的枕大池一次注射自體血法制作SAH大鼠模型。水合氯醛(400 mg/kg BW)經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠后,頭低位30°固定于腦立體定位儀。剪開頭部皮膚暴露環(huán)枕膜,采用微量注射泵向枕大池勻速注射自體非肝素化動脈血(0.1ml/100g BW),3min內(nèi)注射完畢。注血完畢后滯留10min,縫合包扎。手術(shù)過程中采用恒溫毯維持大鼠肛溫在37±1℃。3.神經(jīng)功能評分SAH后48h、72h對三組大鼠神經(jīng)行為學(xué)(食欲、運動和神經(jīng)功能缺損)評分[26]。4.腦組織含水量測定和血腦屏障通透性變化SAH后48h、72h,采用干濕重法測定三組大鼠的腦組織含水量,伊文思藍外滲法評估血腦屏障通透性變化。5.免疫熒光染色觀察大腦皮層IL-1β、IL-6、TNF-α的表達SAH后48h、72h,取腦制作冰凍切片,免疫熒光染色,在熒光顯微鏡下觀察大腦皮層炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的變化。6.ELISA檢測腦組織及外周血液中IL-1β、IL-6、TNFα的含量SAH后48h、72h,取腦組織勻漿,外周血離心,應(yīng)用ELISA試劑盒檢測炎性因子IL-1β、IL-6、TNFα的變化。7.免疫熒光染色觀察大腦皮層小膠質(zhì)細胞的表達SAH后72h,取腦制作冰凍切片切片,免疫熒光染色,觀察大腦皮層小膠質(zhì)細胞的表達情況。8.皮層神經(jīng)元凋亡SAH后48h、72h,取腦制作冰凍切片,行皮層神經(jīng)元actived caspase3和TUNEL免疫熒光染色,觀察神經(jīng)元凋亡的情況。9.基底動脈HE染色SAH后72h,取腦制作石蠟切片,HE染色觀察基底動脈形態(tài),用圖像分析儀測定管腔橫截面積。10.統(tǒng)計學(xué)分析實驗所獲取的數(shù)據(jù)均采用均以均數(shù)±標準差(x±s)表示,Sham組、SAH組和SAH+羅氟司特組之間比較采取the GraphPad Software Prism6.0軟件行雙因素方差分析(two-way analysis of variance,ANOVA),P0.05 表征顯著統(tǒng)計學(xué)差異。研究結(jié)果1.羅氟司特可以改善SAH后神經(jīng)功能缺損SAH后48h、72h,采用三種行為學(xué)檢測評估羅氟司特可能神經(jīng)保護作用。評分結(jié)果統(tǒng)計分析表明,與Sham組相比,SAH組神經(jīng)功能評分顯著增加;與SAH組相比,羅氟司特治療組的神經(jīng)功能評分顯著降低。2.羅氟司特抑制SAH后血腦屏障通透性和腦水腫SAH后48h、72h,檢測羅氟司特對血腦屏障通透性和腦水腫的影響。SAH組的伊文思藍染料外滲量和腦含水量在高于在Sham組。而羅氟司特治療后,SAH誘導(dǎo)的血腦屏障通透性的增加和減少腦水腫顯著降低。3.羅氟司特降低SAH后IL-1β、IL-6和TNFα表達水平SAH后48h、72h,評價羅氟司特對IL-1β、IL-6和TNFα表達水平的影響。使用熒光顯微鏡觀察免疫熒光染色結(jié)果,統(tǒng)計結(jié)果顯示與Sham組相比較,SAH組IL-1β、IL-6和TNFα陽性細胞數(shù)明顯增加。與SAH組比較,羅氟司特給藥后,IL-1β、IL-6和TNFα陽性細胞顯著地減少。ELISA檢測結(jié)果顯示,與Sham組相比,SAH組血清或皮質(zhì)中的IL-1β、IL-6和TNFα含量明顯增加,羅氟司特治療后顯著降低了 IL-1β、IL-6和TNFα的含量。4.羅氟司特降低SAH后小膠質(zhì)細胞表達SAH后72h,免疫熒光染色結(jié)果顯示,與Sham組相比較,SAH組小膠質(zhì)陽性細胞數(shù)明顯增加。然而,羅氟司特治療組小膠質(zhì)細胞陽性細胞數(shù)顯著降低。5.羅氟司特抑制SAH后神經(jīng)元凋亡在SAH誘導(dǎo)后48h和72h,采用active caspase-3/NeuN免疫熒光染色和TUNEL/DAPI染色量化了神經(jīng)元細胞凋亡。統(tǒng)計結(jié)果表明與sham組相比,SAH組active caspase-3陽性細胞明顯增加。然而與SAH組相比,羅氟司特治療組active caspase-3陽性細胞顯著減少。與SAH組相比較,羅氟司特治療組TUNEL陽性細胞明顯減少。6.羅氟司特減弱SAH后早期CVSSAH后72h,HE染色結(jié)果顯示,與Sham組相比較,SAH組基底動脈痙攣明顯,管腔面積減少。然而,羅氟司特治療組基底動脈痙攣得到明顯改善。結(jié)論羅氟司特顯著改善大鼠實驗性SAH后神經(jīng)缺損,降低血腦屏障的滲透性,減弱小膠質(zhì)細胞以及促炎的細胞因子IL-1β、IL-6和TNFα的表達,抑制神經(jīng)細胞凋亡,減輕了 SAH后早期CVS。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R743.3
【圖文】：

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本文編號：2760066