發(fā)布時間：2020-07-16 12:16

【摘要】：目的:通過建立動物缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic-ischemia brain damage,HIBD)模型及體外原代皮層細胞氧糖剝奪再灌注(Oxygen and glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型,對不同時間點新生大鼠腦組織及原代細胞中自噬發(fā)生情況進行分析,探討在不同自噬干預因素的處理下,增加褪黑素在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷早期線粒體自噬中發(fā)揮的作用。方法:將80只7日齡Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機分為假手術(shù)組(Sham組)和模型組(HIBD組)。分別于模型制備完成后0、2、4、6、8、12、24、48h取腦組織,用于Western blot檢測線粒體自噬相關(guān)蛋白Bnip3及自噬相關(guān)蛋白LC3-II表達情況。孕17-19天SD大鼠進行皮層原代細胞培養(yǎng),JC-1染色檢測線粒體膜電位、免疫熒光觀察線粒體自噬情況;于OGD/R模型制備后進行自噬抑制劑3-MA、線粒體自噬抑制劑Mdivi-1、自噬激活劑雷帕霉素(Rapamycin,Rapa),以及褪黑素(Melatonin,MT)進行干預,收集細胞檢測Bnip3、LC3-II表達情況;CCK8檢測細胞活性。TTC染色檢測在不同處理因素下腦梗死灶大小。結(jié)果:1、腦皮層組織中,與Sham組相比,HIBD組Bnip3于0h即有表達,后續(xù)各時間點呈持續(xù)高表達狀態(tài)(P0.05);LC3-II表達從0h開始呈高表達,4h、8h表達明顯(P0.05),余時間點較Sham組均有增加(P0.05)。2、原代培養(yǎng)的皮層細胞中,與正常細胞組(Con)相比,OGD/R組Bnip3同樣于0h即有表達,且后續(xù)各時間點呈持續(xù)高表達狀態(tài)(P0.05);LC3-II表達從0h開始呈高表達,2h有所回落,4h后持續(xù)表現(xiàn)高表達狀態(tài)(P0.05)。3、JC-1線粒體膜電位檢測:與Con組相比,OGD/R組線粒體膜電位下降;3-MA及Mdivi-1處理組線粒體膜電位較OGD/R組下降明顯(P0.05);Rapa及MT組細胞線粒體膜電位較OGD/R組增加(P0.05)。4、免疫熒光檢測線粒體自噬發(fā)生情況:Bnip3及LC3標記的抗體均為紅色熒光,與Con組比較,OGD/R后原代細胞紅色熒光表達數(shù)量增加(P0.05),在OGD/R后各藥物干預處理組中:3-MA及Mdivi-1組Bnip3及LC3紅色熒光表達均減少(P0.05);Rapa及MT組Bnip3及LC3紅色熒光數(shù)量均明顯增加(P0.05)。5、Western Blot結(jié)果:Bnip3及LC3-II在3-MA、Mdivi-1中表達均減少,在Rapa組中表達增加,對各藥物組追加MT后表達較各藥物組均增加。6、CCK8細胞活性檢測結(jié)果:與Con組相比,OGD/R組細胞活性降低,在OGD/R處理基礎(chǔ)上的各藥物組存活度中3-MA、Mdivi-1組細胞活性降低(P0.05),Rapa組細胞活性增加不明顯(P0.05),MT組細胞活性增加(P0.05),各干預組在進行MT共同干預的情況下細胞活性均增加,除3-MA組外,余差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。7、TTC染色結(jié)果:與Sham組相比,HIBD組可見明顯白色梗死灶;3-MA處理組腦梗死面積百分比較HIBD組增加更明顯(P0.05),提示3-MA加重腦損傷;Mdivi-1處理組較HIBD組梗死灶面積百分比增加最明顯(P0.05),且腦損傷區(qū)域波及對側(cè)大腦半球,損傷更嚴重;Rapa處理組梗死面積百分比較HIBD組稍減少(P0.05);單獨MT處理組較HIBD處理組梗死灶面積百分比減輕(P0.05),其與各處理因素同時作用時,梗死灶面積百分比均較各處理組有明顯減輕(P0.05)。結(jié)論:1.缺氧缺血后新生大鼠皮層組織Bnip3、LC3-II蛋白表達均發(fā)生變化,且早期即出現(xiàn)改變,說明無論是自噬還是線粒體自噬在早期腦損傷中發(fā)揮重要作用。2.成功進行胎鼠原代皮層細胞培養(yǎng)并進行體外細胞OGD/R模型構(gòu)建,在細胞層面上對Bnip3、LC3-II的表達情況進行了進一步體外驗證。3.3-MA及Mdivi-1在缺氧缺血早期可加重腦組織損傷,在缺氧缺糖早期可使細胞活性降低;MT可以減輕該損傷,可能在腦損傷早期與Rapa具有協(xié)同保護作用。4.MT通過增強線粒體自噬的發(fā)生,可減輕3-MA、Mdivi-1抑制線粒體自噬后造成的腦損傷,在早期缺氧缺血性腦損傷中發(fā)揮著保護作用。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R742
【圖文】：

15C1 A 為 Western Blot 檢測各時間點 Bnip3、LC3-II 表達情況 B 為皮達情況 C 為皮層組織中 LC3-II 的表達情況 .*示與 Sham 組比較0.01；***為 P<0.001缺氧缺糖原代皮層細胞中 Bnip3、LC3-II 表達情況常細胞組（Con）相比，OGD/R 組同樣線粒體自噬相關(guān)蛋白 Bni并且后續(xù)各時間點呈持續(xù)高表達狀態(tài)（P<0.05）；自噬相關(guān)蛋白 L呈高表達，2h 有所回落，4h 后持續(xù)表現(xiàn)高表達狀態(tài)（P<0.05），義。

16C 2 A 為 Western Blot 檢測各時間點 Bnip3、LC3-II 表達情況 B 為皮層 表達情況 C 為皮層細胞中 LC3-II 的表達情況 *示與 Con 組比較，P<P<0.01；***為 P<0.001

粒體自噬在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷早期發(fā)揮保護作用的研究 光結(jié)果鏡下觀察：Bnip3 及 LC3 均標記的線粒體自噬抗體均為OGD/R 后原代細胞紅色熒光表達數(shù)量增加（P<0.05），說噬發(fā)生增加。在 OGD/R 后各藥物干預處理組中：3-MA 紅色熒光表達均減少（P<0.05），線粒體自噬發(fā)生減低； 紅色熒光數(shù)量均明顯增加（P<0.05），線粒體自噬增加�？梢詫�粒體自噬發(fā)生情況加以控制，可用于后續(xù)實驗

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

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相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 韓敬哲;雷帕霉素對SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠線粒體質(zhì)量控制機制的影響[D];河北醫(yī)科大學;2012年

本文編號：2757992