本文關(guān)鍵詞：microRNA-134在圍術(shù)期缺血性腦卒中的作用及其分子機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:探討microRNA-134(miR-134)在圍術(shù)期缺血性腦卒中的作用及其可能的分子機制。方法:本實驗利用培養(yǎng)的乳鼠原代細胞氧-糖剝奪(OGD)模擬離體細胞缺血模型和小鼠腦中動脈阻塞(MCAO)致缺血性腦卒中整體動物模型,借助生物化學(xué)、分子生物學(xué)、神經(jīng)行為學(xué)和形態(tài)學(xué)等學(xué)科研究技術(shù)進行研究。1.研究缺血后不同時間點小鼠腦組織和離體培養(yǎng)神經(jīng)元內(nèi)miR-134表達量的變化和神經(jīng)元損傷情況。在細胞水平上,采用1h OGD方法制作細胞缺血損傷模型,實驗分組包括正常組(Normal)和氧-糖缺失組(1h OGD/reoxygenation),后者包括復(fù)糖復(fù)氧后12h、1d、3d、7d四組。在動物水平上,采用1h腦中動脈阻塞(1h MCAO)致缺血性腦卒中,實驗分組包括:正常組(Normal)、假手術(shù)組(Sham)和MCAO再灌組(1h MCAO/reperfusion),MCAO再灌組又包括再灌12h、1d、3d、7d四組。首先使用實時定量RT-PCR技術(shù),檢測原代培養(yǎng)腦皮層神經(jīng)元在1h OGD后不同復(fù)糖復(fù)氧時間和小鼠1h MCAO后不同再灌時間miR-134表達量的變化;利用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測神經(jīng)元生存率,尼氏染色檢測鼠腦神經(jīng)元的缺失情況;利用Western blotting檢測神經(jīng)元內(nèi)Caspase-3活化水平即cleaved-caspase-3蛋白的表達水平以反映細胞凋亡情況。2.研究miR-134對缺血性腦損傷的作用及其機制。(1)在細胞水平上,采用1h OGD/24h reoxygenation方法制作細胞缺血損傷模型,實驗分組包括:正常組(Normaxia)和模型組(1h OGD/reoxygenation),后者又分為非轉(zhuǎn)染組(Non-trans)、miR對照組(miR Ctrl)、miR-134前體組(Pre-miR-134)和miR-134抑制劑組(pre-mir-134inhibitor)。首先利用實時定量rt-pcr技術(shù),檢測原代培養(yǎng)腦皮層神經(jīng)元轉(zhuǎn)染病毒載體后mir-134的表達情況,然后用mtt檢測不同轉(zhuǎn)染組1hogd/24hreoxygenation后原代培養(yǎng)腦皮層神經(jīng)元缺血損傷的情況;使用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記(tunel)方法和檢測caspase-3活化水平,觀察mir-134對ogd致原代培養(yǎng)腦皮層神經(jīng)元凋亡的影響;通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?檢測mir-134和其預(yù)測靶基因mrna的3?-utr序列是否存在直接作用位點,選出直接作用的靶基因;使用蛋白免疫印跡(westernblot)方法進一步驗證過表達或抑制mir-134對hspa12b蛋白的調(diào)節(jié)作用;最后,共轉(zhuǎn)染hspa12bsirna利用mtt法和westernblot法進一步檢測mir-134在原代細胞缺血性損傷中的作用及是否直接對hspa12b蛋白的有調(diào)控作用。(2)在動物水平上,利用1hmcao/24hreperfusion模型模擬缺血性腦卒中,實驗分組包括:假手術(shù)組(sham)、mcao再灌組、腦皮質(zhì)注射攜帶mir-134抑制劑慢病毒載體mcao再灌(mcao+pre-mir-134inhibitor)及其對照組。應(yīng)用實時定量rt-pcr技術(shù),觀察腦皮質(zhì)注射病毒載體后mir-134的表達情況;運用神經(jīng)行為學(xué)評分、nissl染色和ttc染色等方法,評價mir-134對小鼠腦缺血再灌注損傷程度的影響;應(yīng)用蛋白免疫印跡方法,檢測缺血小鼠腦組織mir-134對其預(yù)測靶基因hspa12b蛋白表達的影響。結(jié)果:1.原代培養(yǎng)腦皮層神經(jīng)元1hogd后,與正常組相比,復(fù)糖復(fù)氧12h-7d過程中mir-134的表達水平明顯升高,細胞存活率明顯降低,在1d時最明顯。與正常組相比,在動物1hmcao再灌1d時mir-134的表達水平最高,之后逐漸降低;神經(jīng)細胞缺失最重,之后缺失情況減輕;caspase-3活化水平最高,之后表達量也逐漸降低;假手術(shù)組mir-134表達量及神經(jīng)元損傷情況差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。2.(1)與正常組比較,在ogd致神經(jīng)元缺血損傷中mir-134前體組,mir-134的表達水平明顯提高,細胞存活率明顯降低,hspa12b蛋白水平明顯降低,熒光素酶活性也明顯降低;而mir-134抑制劑組mir-134的表達水平明顯降低,細胞存活率顯著提高,hspa12b蛋白水平明顯提高,熒光素酶活性也明顯升高;但各組之間hspa12bmrna水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。hspa5熒光素酶活性水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。共轉(zhuǎn)染hspa12bsirna之后,hspa12b蛋白表達量明顯降低,細胞存活率較單轉(zhuǎn)染mir-134前體更低,神經(jīng)元中裂解的caspase-3(激活)的水平也明顯增高。(2)與mcao組比較,mir-134抑制劑組神經(jīng)行為學(xué)評分降低,小鼠腦梗死體積明顯減小,皮層神經(jīng)細胞的損傷降低,而且缺血性腦卒中小鼠腦內(nèi)cl-caspase-3表達水平也明顯減低低;相反,miRNA-134的靶蛋白HSPA12B的表達水平明顯升高。結(jié)論:miR-134通過負性調(diào)控HSPA12B蛋白表達水平,在OGD和MCAO致神經(jīng)元缺血性損傷中發(fā)揮重要作用,為圍術(shù)期缺血性腦損傷早期防治及預(yù)后提供實驗依據(jù)、有效的生物分子標記物和新的治療靶點,同時進一步豐富人們對腦缺血/低氧性損傷機制的認識。
【關(guān)鍵詞】：缺血性腦卒中 miR-134 熱休克蛋白A12B 氧-糖剝奪(OGD) 大腦中動脈阻塞(MCAO)
【學(xué)位授予單位】：濰坊醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R743.3
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 符號說明10-11
• 前言11-14
• 材料與方法14-29
• 結(jié)果29-33
• 討論33-36
• 結(jié)論36-37
• 附圖表37-47
• 參考文獻47-51
• 文獻綜述 miRNA和HSP70在缺血性腦卒中的作用及研究進展51-63
• 參考文獻59-63
• 致謝63-64
• 攻讀學(xué)位期間撰寫的論文64

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本文編號：275505