本文關(guān)鍵詞：microRNA-134在圍術(shù)期缺血性腦卒中的作用及其分子機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:探討microRNA-134(miR-134)在圍術(shù)期缺血性腦卒中的作用及其可能的分子機(jī)制。方法:本實(shí)驗(yàn)利用培養(yǎng)的乳鼠原代細(xì)胞氧-糖剝奪(OGD)模擬離體細(xì)胞缺血模型和小鼠腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)致缺血性腦卒中整體動(dòng)物模型,借助生物化學(xué)、分子生物學(xué)、神經(jīng)行為學(xué)和形態(tài)學(xué)等學(xué)科研究技術(shù)進(jìn)行研究。1.研究缺血后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠腦組織和離體培養(yǎng)神經(jīng)元內(nèi)miR-134表達(dá)量的變化和神經(jīng)元損傷情況。在細(xì)胞水平上,采用1h OGD方法制作細(xì)胞缺血損傷模型,實(shí)驗(yàn)分組包括正常組(Normal)和氧-糖缺失組(1h OGD/reoxygenation),后者包括復(fù)糖復(fù)氧后12h、1d、3d、7d四組。在動(dòng)物水平上,采用1h腦中動(dòng)脈阻塞(1h MCAO)致缺血性腦卒中,實(shí)驗(yàn)分組包括:正常組(Normal)、假手術(shù)組(Sham)和MCAO再灌組(1h MCAO/reperfusion),MCAO再灌組又包括再灌12h、1d、3d、7d四組。首先使用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù),檢測(cè)原代培養(yǎng)腦皮層神經(jīng)元在1h OGD后不同復(fù)糖復(fù)氧時(shí)間和小鼠1h MCAO后不同再灌時(shí)間miR-134表達(dá)量的變化;利用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測(cè)神經(jīng)元生存率,尼氏染色檢測(cè)鼠腦神經(jīng)元的缺失情況;利用Western blotting檢測(cè)神經(jīng)元內(nèi)Caspase-3活化水平即cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平以反映細(xì)胞凋亡情況。2.研究miR-134對(duì)缺血性腦損傷的作用及其機(jī)制。(1)在細(xì)胞水平上,采用1h OGD/24h reoxygenation方法制作細(xì)胞缺血損傷模型,實(shí)驗(yàn)分組包括:正常組(Normaxia)和模型組(1h OGD/reoxygenation),后者又分為非轉(zhuǎn)染組(Non-trans)、miR對(duì)照組(miR Ctrl)、miR-134前體組(Pre-miR-134)和miR-134抑制劑組(pre-mir-134inhibitor)。首先利用實(shí)時(shí)定量rt-pcr技術(shù),檢測(cè)原代培養(yǎng)腦皮層神經(jīng)元轉(zhuǎn)染病毒載體后mir-134的表達(dá)情況,然后用mtt檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組1hogd/24hreoxygenation后原代培養(yǎng)腦皮層神經(jīng)元缺血損傷的情況;使用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(tunel)方法和檢測(cè)caspase-3活化水平,觀察mir-134對(duì)ogd致原代培養(yǎng)腦皮層神經(jīng)元凋亡的影響;通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),檢測(cè)mir-134和其預(yù)測(cè)靶基因mrna的3?-utr序列是否存在直接作用位點(diǎn),選出直接作用的靶基因;使用蛋白免疫印跡(westernblot)方法進(jìn)一步驗(yàn)證過(guò)表達(dá)或抑制mir-134對(duì)hspa12b蛋白的調(diào)節(jié)作用;最后,共轉(zhuǎn)染hspa12bsirna利用mtt法和westernblot法進(jìn)一步檢測(cè)mir-134在原代細(xì)胞缺血性損傷中的作用及是否直接對(duì)hspa12b蛋白的有調(diào)控作用。(2)在動(dòng)物水平上,利用1hmcao/24hreperfusion模型模擬缺血性腦卒中,實(shí)驗(yàn)分組包括:假手術(shù)組(sham)、mcao再灌組、腦皮質(zhì)注射攜帶mir-134抑制劑慢病毒載體mcao再灌(mcao+pre-mir-134inhibitor)及其對(duì)照組。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量rt-pcr技術(shù),觀察腦皮質(zhì)注射病毒載體后mir-134的表達(dá)情況;運(yùn)用神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、nissl染色和ttc染色等方法,評(píng)價(jià)mir-134對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷程度的影響;應(yīng)用蛋白免疫印跡方法,檢測(cè)缺血小鼠腦組織mir-134對(duì)其預(yù)測(cè)靶基因hspa12b蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:1.原代培養(yǎng)腦皮層神經(jīng)元1hogd后,與正常組相比,復(fù)糖復(fù)氧12h-7d過(guò)程中mir-134的表達(dá)水平明顯升高,細(xì)胞存活率明顯降低,在1d時(shí)最明顯。與正常組相比,在動(dòng)物1hmcao再灌1d時(shí)mir-134的表達(dá)水平最高,之后逐漸降低;神經(jīng)細(xì)胞缺失最重,之后缺失情況減輕;caspase-3活化水平最高,之后表達(dá)量也逐漸降低;假手術(shù)組mir-134表達(dá)量及神經(jīng)元損傷情況差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.(1)與正常組比較,在ogd致神經(jīng)元缺血損傷中mir-134前體組,mir-134的表達(dá)水平明顯提高,細(xì)胞存活率明顯降低,hspa12b蛋白水平明顯降低,熒光素酶活性也明顯降低;而mir-134抑制劑組mir-134的表達(dá)水平明顯降低,細(xì)胞存活率顯著提高,hspa12b蛋白水平明顯提高,熒光素酶活性也明顯升高;但各組之間hspa12bmrna水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。hspa5熒光素酶活性水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。共轉(zhuǎn)染hspa12bsirna之后,hspa12b蛋白表達(dá)量明顯降低,細(xì)胞存活率較單轉(zhuǎn)染mir-134前體更低,神經(jīng)元中裂解的caspase-3(激活)的水平也明顯增高。(2)與mcao組比較,mir-134抑制劑組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分降低,小鼠腦梗死體積明顯減小,皮層神經(jīng)細(xì)胞的損傷降低,而且缺血性腦卒中小鼠腦內(nèi)cl-caspase-3表達(dá)水平也明顯減低低;相反,miRNA-134的靶蛋白HSPA12B的表達(dá)水平明顯升高。結(jié)論:miR-134通過(guò)負(fù)性調(diào)控HSPA12B蛋白表達(dá)水平,在OGD和MCAO致神經(jīng)元缺血性損傷中發(fā)揮重要作用,為圍術(shù)期缺血性腦損傷早期防治及預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)、有效的生物分子標(biāo)記物和新的治療靶點(diǎn),同時(shí)進(jìn)一步豐富人們對(duì)腦缺血/低氧性損傷機(jī)制的認(rèn)識(shí)。
【關(guān)鍵詞】：缺血性腦卒中 miR-134 熱休克蛋白A12B 氧-糖剝奪(OGD) 大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)
【學(xué)位授予單位】：濰坊醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R743.3
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 符號(hào)說(shuō)明10-11
• 前言11-14
• 材料與方法14-29
• 結(jié)果29-33
• 討論33-36
• 結(jié)論36-37
• 附圖表37-47
• 參考文獻(xiàn)47-51
• 文獻(xiàn)綜述 miRNA和HSP70在缺血性腦卒中的作用及研究進(jìn)展51-63
• 參考文獻(xiàn)59-63
• 致謝63-64
• 攻讀學(xué)位期間撰寫的論文64

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  本文關(guān)鍵詞：microRNA-134在圍術(shù)期缺血性腦卒中的作用及其分子機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：275505