【摘要】：目的:通過(guò)對(duì)H_2TPyP(5,10,15,20-4(4-pyridine)porphyrin)進(jìn)行修飾,制備得到TCMePyP(5,10,15,20-Tetrakis-(N-carboxymethyl-4-pyridinium)p orphyrin tetrabromide),研究TCMePyP的物理化學(xué)性質(zhì)和光動(dòng)力作用下對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的殺傷作用及機(jī)理。研究Q[7]-TCMePyP及Q[7]-anch ored-PAA負(fù)載TCMePyP光動(dòng)力作用下對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的殺傷作用。方法:合成TCMePyP,利用二維核磁譜圖表征及研究其動(dòng)態(tài)激光散射光譜。測(cè)定H_2TPy P及TCMePyP紫外-可見(jiàn)光吸收光譜和熒光光譜。使用SOSG(Singlet Oxygen S ensor Green)對(duì)其細(xì)胞外單線態(tài)氧進(jìn)行檢測(cè)。利用MTT比色法檢測(cè)TCMePyP對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的生存率的影響。激光共聚焦顯微鏡下觀察其細(xì)胞內(nèi)定位,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)光動(dòng)力過(guò)程中產(chǎn)生ROS的變化。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TCM ePyP-PDT誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TCMePyP在光動(dòng)力作用下SH-SY5Y細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)與修復(fù)能力。MTT比色法檢測(cè)TCMePyP、Q[7]-TCMePyP及Q[7]-anchored PAA負(fù)載TCMePyP,光動(dòng)力作用下SH-SY5Y細(xì)胞的生存率的影響。激光共聚焦顯微鏡下觀測(cè)TCMePyP、Q[7]-TCMePyP及Q[7]-anchored PAA負(fù)載TCMePyP在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)熒光量的變化。結(jié)果:二維核磁譜圖表征TC MePyP結(jié)構(gòu)。動(dòng)態(tài)激光散射光譜表明,TCMePyP溶液表現(xiàn)出單峰分布,水合動(dòng)力學(xué)直徑顯著減小。10μmol/L TCMePyP的紫外-可見(jiàn)吸收明顯增加,λ_(ex)=515nm時(shí),TCMePyP熒光強(qiáng)度增大。525nm激光照射1×10~(-5) mol/L TCMePyP 11min時(shí),單線態(tài)氧產(chǎn)生達(dá)最高。光照密度(10.48 mW/cm~2),光照時(shí)間1min-9min,525nm、660nm激光的細(xì)胞光毒性極低(P0.05);TCMePyP:2.5μmol/L-80μmol/L,SH-SY5Y細(xì)胞暗毒性極低(P0.05)。525nm激光照射10μmol/L、50μmol/L TCMePyP,細(xì)胞生存率受到明顯抑制,10μmol/L TCMePyP,細(xì)胞殺傷效果更強(qiáng),細(xì)胞生存率隨光照時(shí)間呈下降趨勢(shì)。通過(guò)倒置顯微鏡觀察到,隨光照時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)明顯改變,壞死細(xì)胞逐漸增多。光動(dòng)力作用24小時(shí)后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到,TCMePyP-PDT下細(xì)胞凋亡率明顯增加(P0.01)。在激光共聚焦顯微鏡下觀察到,TCMePyP定位于SH-SY5Y細(xì)胞的胞質(zhì),進(jìn)行光照后,定位于細(xì)胞核。TCMePyP光照3min及5min時(shí),激光共聚焦顯微鏡檢測(cè):ROS產(chǎn)生明顯增多(P0.05)。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示,TCMePyP-PDT明顯抑制了SH-SY5Y細(xì)胞的遷移能力(P0.05)。濃度5μmol/L,TCMePyP、Q[7]-TCMePyP和Q[7]-P AA-TCMePyP隨光照時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞生存率呈降低趨勢(shì),Q[7]-PAA-TCMePy P組殺傷更明顯(P0.05)。525nm激光照射2min各濃度組Q[7]-PAA-TCMeP yP組較TCMePyP組及Q[7]-TCMePyP組而言,對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞殺傷更明顯(P0.05)。共聚焦顯微鏡下測(cè)定到5μmol/LQ[7]-TCMePyP及Q[7]-PAA-TCMePy P可使SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)的熒光增強(qiáng)。結(jié)論:與H2TPyP比較,TCMePyP的水溶性明顯改善,可見(jiàn)光區(qū)吸收增強(qiáng),發(fā)射熒光更強(qiáng)。光照條件下單線態(tài)氧產(chǎn)率較高、光毒性、暗毒性低、細(xì)胞定位明確。光動(dòng)力處理后SH-SY5Y細(xì)胞殺傷更明顯。瓜環(huán)Q[7]及瓜環(huán)Q[7]-anchored PAA納米顆粒負(fù)載新型水溶性卟啉化合物(TC MePyP)后,均能使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度增大,對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的殺傷作用增強(qiáng),表明瓜環(huán)及瓜環(huán)聚合物納米顆粒具有藥物載體的特征。
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R739.4
【圖文】：

倒置熒光顯微鏡 Ts-2磁力攪拌器（85-2A）納米粒度 Zeta 電位儀流式細(xì)胞儀（NovoCtye）日本尼康上海滬析公司英國(guó)馬爾文公司中國(guó)杭州艾森生物公司1.2 方法1.2.1 TCMePyP 的制備及表征1.2.1.1 5，10，15，20-四(4-吡啶基)卟啉鹽酸鹽 (H2TPyPH)的制備將 H2TPyP（123.7mg，約 0.2mmol）置于 50mL 圓底燒瓶中，加入約 8mL三氯甲烷使其完全溶解，緩慢加入 HCl（1mol）約 3mL，溶液中出現(xiàn)綠色沉淀，待反應(yīng)完全，減壓過(guò)濾，濾餅用三氯甲烷（20mL）洗滌兩次，之后用丙酮（20mL）洗滌兩次，得綠色產(chǎn)物。得到固體產(chǎn)物 93mg，產(chǎn)率為 60.86%。1.2.1.2 TCMePyP 的制備

外細(xì)胞不予計(jì)數(shù)，若細(xì)胞壓在格上，按數(shù)上不數(shù)中細(xì)胞相加，除以 4，乘以 10000，所得細(xì)胞個(gè)SH-SY5Y 細(xì)胞懸液長(zhǎng)期細(xì)胞，PBS 液 3mL 洗滌細(xì)胞兩次，排盡，加內(nèi)靜置 2min，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞梭型變液，終止胰酶消化，巴氏吸管反復(fù)吹吸細(xì)胞及移入 15mL 離心管中，1500rpm，離心 5min，去4mL，反復(fù)吹吸，見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)塊消失，細(xì)胞懸液制Y5Y 細(xì)胞布板動(dòng)力治療過(guò)程中，激光照射對(duì)臨近孔的干擾，采臨孔不接種細(xì)胞。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 2×104個(gè)/孔細(xì)入 PBS 液，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h，倒板底部，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果2.1 核磁譜圖解析從圖 2-1 中可以得到1HHMR（400MHz，DMSOd6，25℃）：δ 9.47（d，8H，J=8Hz），δ9.16（s，8H），δ 9.98（d，8H，J = 8Hz），δ 4.70（s，8H），-3.12（s，2H）。在卟啉骨架中，吡啶環(huán)上的 H 以及吡咯上的 H 由于分子的共軛效應(yīng)，化學(xué)位移應(yīng)位于低場(chǎng)，所以 δ 4.70 處的 H 應(yīng)歸屬于吡啶 N 上的亞甲基，且低場(chǎng)處的兩組二重峰應(yīng)歸屬于卟啉骨架吡啶環(huán)上的 H，即 δ 9.47 和 δ 8.98。通過(guò)g-COSY 與ROSY NMR二維核磁譜圖對(duì)卟啉骨架吡啶環(huán)上的H進(jìn)行歸屬，如 ROSY 圖所示，圖中 δ 4.70 的 H 與 δ 9.47 的 H 相關(guān)聯(lián)，而在 g-COSY 譜圖中并沒(méi)有相關(guān)聯(lián)，說(shuō)明吡啶 N 上的亞甲基的 H 距離 δ 9.47 的 H 在空間上更靠近，所以 δ 9.47 的 H 歸屬于卟啉骨架吡啶環(huán)上的 Hα，則 δ 8.98 歸屬于卟啉骨架吡啶環(huán)上的 Hβ。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2753748