【摘要】：目的:神經病理性疼痛(Neuropathic pain,NP)臨床多見且治療效果不夠理想,有必要進一步探索其機制以揭示新的治療靶點。脊髓背角(Spinal dorsal horn,SDH)是疼痛信號傳導和局部加工的初級中樞。T型鈣通道(Cav3)是低電壓激活鈣通道,可調控多種細胞的興奮性。在NP動物模型中,SDH的Cav3被異常激活,表現(xiàn)為Cav3表達上調及神經元T型鈣電流增加。此外,有研究發(fā)現(xiàn)星形膠質細胞中鈣離子的內流可激活胞內一系列細胞因子的釋放,從而激活周邊神經元,以參與調控NP的發(fā)生發(fā)展。然而,Cav3的細胞亞型特異性表達與NP的產生和維持是否有關仍不清楚。因此,我們利用疼痛模型研究了疼痛時Cav3表達的變化,并探討Cav3.2表達上調對星形膠質細胞激活的調控作用,以期為NP機制的研究和鎮(zhèn)痛藥物的開發(fā)提供新的理論依據。方法:選取成年雄性SD大鼠(150~200 g),建造福爾馬林急性炎性痛和坐骨神經部分結扎(Partial sciatic nerve ligation,PSNL)慢性NP模型(部分動物同時實施鞘內置管術),并采用免疫組化染色、免疫印跡、qPCR方法觀察SDH中Cav3表達的變化。通過雙標免疫組化染色法,觀察PSNL大鼠SDH中Cav3.2與GFAP、OX42、Neu N的共染情況。而后在PSNL大鼠連續(xù)鞘內給予Cav3通道阻滯劑米貝地爾與星形膠質細胞抑制劑氟代檸檬酸14天,并通過免疫組化染色觀察藥物對Cav3.2與GFAP在SDH表達的影響。結果:1.經后足皮下注射福爾馬林的大鼠出現(xiàn)典型的雙相傷害性反應,SDH中c-Fos蛋白表達明顯增加,而Cav3各亞型的染色強度未見明顯改變;2.PSNL術后大鼠術側后爪出現(xiàn)機械痛敏,SDH中Cav3.2蛋白與mRNA表達在術后14天均顯著增加,而Cav3.1和Cav3.3的染色強度未見明顯變化;3.PSNL大鼠中增強的Cav3.2特異性染色與星形膠質細胞標記物GFAP共染,但與小膠質細胞標記物OX42及神經元核標記物NeuN未見明顯共染;4.PSNL大鼠Cav3.2上調先于GFAP染色的增強:Cav3.2染色從術后1天開始增強,而GFAP染色從術后7天開始明顯增強,并都持續(xù)到術后14天,但NeuN染色未見任何顯著變化;5.連續(xù)鞘內給予米貝地爾可緩解PSNL誘導的機械痛敏,同時降低Cav3.2與GFAP的表達;而氟代檸檬酸在緩解痛敏時僅減少GFAP的表達,對Cav3.2的表達無明顯作用。結論:急性炎性痛不影響SDH的Cav3表達;NP狀態(tài)下SDH中Cav3.2表達增加,而Cav3.1和Cav3.3的表達不受影響。表達增加的Cav3.2主要位于星形膠質細胞上且發(fā)生在星形膠質細胞激活之前,而Cav3通道阻滯劑可產生鎮(zhèn)痛作用并抑制Cav3.2和GFAP表達的增加,提示Cav3.2可能是NP發(fā)生發(fā)展過程中促進星形膠質細胞激活的一種新型調控因子。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R741
【圖文】：

圖 2.1 福爾馬林炎性痛模型制備：右后足背皮下注射過程及大鼠縮足、舔足行為圖。.3.2 大鼠神經病理性疼痛模型制備取雄性 SD 大鼠 70 只，隨機分為模型組（PSNL，n = 54）和假手術組（Sha = 16）。模型組大鼠行 PSNL 手術，假手術組大鼠只暴露坐骨神經不結扎， Von Frey 法在術前及術后 1、3、7、10、14 天測定大鼠術側（右）和對側（左爪機械刺激縮足閾值，以評估機械痛敏的產生。模型組大鼠取材后行以下：1）免疫組化染色（n = 5/時間點）：分別在術后 1、3、7、10、14 天取材2）免疫印跡（n = 6）：術后 14 天取材；3）實時熒光定量 PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR）（n = 6）：術4 天取材；4）經腰椎連續(xù)鞘內注射給藥（n = 17）：連續(xù)鞘內注射給藥后 14 天取材疫組化染色。假手術組大鼠在術后 14 天取材分別行免疫組化染色（n = 5）、免疫印跡（

PSNL 模型制備及機械痛敏評估。A：坐骨神經解剖示意圖（紅色線圈標示結扎NL 手術坐骨神經暴露與結扎圖；B：電子 Von Frey 機械測痛儀監(jiān)測縮足閾值圖 經腰椎連續(xù)鞘內注射給藥17 只雄性 SD 大鼠在行 PSNL 術前隨機分為三組，即生理鹽水組（i.t. Sa.25 μl/h 速率連續(xù)鞘內注射生理鹽水作為對照，n = 5；米貝地爾組fradil）：以 0.7 μg/h[28]速率連續(xù)鞘內注射米貝地爾，n = 6；氟代檸檬酸i.t. Fluorocitrate）：以 1 nmol/h[47]速率連續(xù)鞘內注射 FC，n = 6。各組均束后立即開始連續(xù)鞘內給藥并持續(xù) 14 天，給藥膠囊內液體體積均為 滲透速率均為 0.25 μl/h。參照 Storkson[49]和 Chen[28]等人方法行腰椎穿刺置管術：雄性 SD 大鼠麻醉后，取俯臥位，背部去毛，常規(guī)碘伏消毒。在無菌操作條件下以髂棘連線與脊柱交點為中心作 2 cm 縱切口，分離肌肉暴露 L5-L6 棘突棘間韌帶暴露黃韌帶。去尖 22 G 針頭穿刺黃韌帶，觀察到大鼠出現(xiàn)突甩尾后表示到達蛛網膜下腔，立即拔針。用鑷子輕柔的將連接植入式藥膠囊（0.25 μl/h，14-day）的 PE-10 導管（OD：0.5 mm，ID：0.25

22圖 3.1 福爾馬林誘導急性炎性痛對 SDH 中 Cav3 表達無明顯影響。A：右后足背皮下注射生理鹽水或福爾馬林溶液后 60 min 內觀察到的大鼠疼痛反應時間的比較；B：生理鹽水與福爾馬林注射后 SDH 中 c-Fos 蛋白（紅色）表達陽性細胞的免疫組化染色代表圖，標尺為 200 m；C：生理鹽水組與福爾馬林組大鼠 SDH 淺層（I-II）和深層（III-IV）c-Fos 陽性細胞計數(shù)的柱狀圖；D：生理鹽水組與福爾馬林組大鼠 SDH 注射側 Cav3.1-3.3（綠色）的免疫組化染色代表圖，標尺為 100 m；E：生理鹽水組與福爾馬林組 SDH Cav3.1-3.3 染色的相對平均熒光強度分析柱狀圖。各組 n = 6；* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，福爾馬林組與生理鹽水組比較。為驗證免疫組化染色抗體的特異性，我們進行了抗原預吸附實驗，以檢測SDH 中 Cav3.1-3.3 染色的特異性。如圖 3.2 所示，圖 B 為 Cav3.1-3.3 陽性對照染色圖，可見 Cav3.1-3.3 在 SDH 均有明顯染色（綠色）；而在圖 A 的免疫預吸

【參考文獻】

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1 戶雪雪;彭慧湞;程小娥;馮小金;馬龍先;蔣昌宇;柳濤;;米諾環(huán)素緩解大鼠炎性痛的脊髓機制[J];中華醫(yī)學雜志;2017年32期

本文編號：2749147