【摘要】：研究背景與目的腦卒中是全球致死率和致殘率最高的三大疾病之一,其中87%是腦梗死。對于急性腦梗死,目前唯一被FDA批準的藥物治療手段是早期溶栓。但溶栓時間窗限制相對嚴格,95%以上的患者無法在發(fā)病時間窗內(nèi)到達醫(yī)院進行溶栓治療。我國已經(jīng)慢慢步入老齡化社會,腦卒中致死率、致殘率逐年升高,并且嚴重降低了患者的生存質量、平均壽命,給國民經(jīng)濟帶來沉重的負擔。因此,科研人員探索新的、能夠覆蓋更多患者的缺血性腦卒中治療策略具有極其重要的現(xiàn)實意義。近幾年,涌現(xiàn)出許多神經(jīng)干細胞在腦卒中治療領域的機制研究,這為解決腦卒中這一世界性難題提供了新的思路和方法。在急性腦卒中的研究中,神經(jīng)干細胞(Neural stem cells,NSCs)對于微血管內(nèi)皮細胞的保護作用尚不明確。腦微血管內(nèi)皮細胞(Brain microvascular endothelial cells,BMECs)不僅是腦微血管腔的內(nèi)襯細胞,更能分泌活性因子來影響神經(jīng)元的功能狀態(tài)。BMECs的損傷是急性腦梗死后缺血再灌注損傷的基本動因。由于缺血再灌注損傷,BMECs發(fā)生水腫,暴露皮下膠原。最終,導致白細胞、血小板粘附,微血栓形成;同時BMECs的線粒體受損,被強烈激活進行氧化活動,產(chǎn)生大量氧自由基,加重腦組織損傷。然而,目前在神經(jīng)干細胞治療腦梗死的研究中,多數(shù)研究聚焦于受損神經(jīng)組織的修復,而對于腦梗死后缺血再灌注損傷中,NSCs對BMECs的保護作用尚不清楚。為此,本研究就NSCs修復缺血再灌注損傷BMECs的機制進行了一系列實驗探索。本研究證實了NSCs可以通過直接接觸的方式保護缺血再灌注損傷的內(nèi)皮細胞。在實驗中,我們成功分離和培養(yǎng)了NSCs和BMECs;為了進一步模擬缺血再灌注損傷中腦微血管內(nèi)皮細胞所處的病理生理條件,我們建立了NSCs和BMECs的共培養(yǎng)模型;并證實了NSCs能與BMECs形成隧道納米管(Tunneling nanotubes,TNTs),這是一種只在哺乳動物細胞間形成的橋連,是一種細胞間的特殊連接方式,主要由a-微管蛋白和絲狀肌動蛋白聚合構成,可進行長距離的線粒體轉運。TNT是由表層的細胞膜和內(nèi)部的細胞骨架構成,其長度和直徑可在較大范圍內(nèi)波動,不同類型的細胞和不同的培養(yǎng)條件可能會造成程度上的差異。TNT可以介導了細胞間的物質運輸和信號交流,憑借其較寬口徑以及相對較長的長度,在轉運分子量較大的物質甚至細胞器上擁有得天獨厚的優(yōu)勢。(1)在該研究中鑒定發(fā)現(xiàn)了BMECs和NSCs之間TNT的形成,以及MSEC基因對TNTs形成的促進作用、諾考達唑(Nocodazole,微管蛋白解聚劑)對TNTs的抑制作用。(2)因TNT缺少特異性標記物,將NSCs添加MSEC或Nocodazole預處理來影響TNT形成,對MCAO模型進行干細胞移植治療。檢測主要氧化應激因子SOD、H_2O_2、T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px和MDA表達的變化;分析預處理因素在線粒體凋亡信號通路中的作用差異,及其對MCAO模型病理學、功能學上的作用和機制。本研究主要通過離體實驗、在體實驗探究NSCs在腦卒中治療作用新機制,為干細胞療法進一步造福人類提供一定的理論依據(jù)。實驗方法細胞實驗部分(1)原代分離培養(yǎng)神經(jīng)干細胞、腦微血管內(nèi)皮細胞;(2)Nestin抗體鑒定原代培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞、Ⅷ因子抗體鑒定分離出來腦微血管內(nèi)皮細胞;(3)構建了神經(jīng)干細胞、腦微血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)模型;(4)對腦微血管內(nèi)皮細胞進行CFSE標記;(5)對神經(jīng)干細胞進行線粒體mitotracker示蹤;(6)構建MSEC慢病毒;(7)對神經(jīng)干細胞進行MSEC轉染或Nocodazole預處理;(8)抽提預處理各組神經(jīng)干細胞普通RNA,PCR檢測ki-67表達水平;(9)激光共聚焦顯微鏡觀察TNTs形成;動物實驗部分(1)MCAO模型建立;準備MSEC慢病毒感染、Nocodazole預處理神經(jīng)干細胞、空病毒轉染神經(jīng)干細胞和PBS預處理神經(jīng)干細胞作為對照組;(2)對MCAO模型進行神經(jīng)干細胞移植;(3)作冰凍切片染色,對移植細胞進行示蹤;電鏡觀察血腦屏障附近結構;(4)TTC染色明確腦梗模型建立,并比較腦梗塞面積;(5)尼氏體染色,觀察神經(jīng)干細胞移植后腦組織形態(tài)學改變,并計數(shù)神經(jīng)元;(6)對各組MCAO模型鼠進行mNSS行為功能學評分;(7)檢測動物模型中氧化應激相關因子表達變化;(8)Western Blot檢測對MCAO模型干預后,線粒體凋亡通路上的關鍵分子Bcl-2、Bax和Cyt-c的表達。結果(1)原代培養(yǎng)的BMECsⅧ因子抗原陽性,NSCs Nestin抗原陽性。證明細胞分離成功;(2)結果證明BMECs、NSCs共培體系中存在有TNTs形成;(3)過表達MSEC基因可以促進TNT形成,Nocodazole預處理NSCs抑制細胞間TNT形成;(4)MSEC過表達病毒轉染和Nocodazole預處理操作不影響NSCs的增殖活性;(5)構建小鼠MCAO模型,TTC染色顯示單側腦梗塞病灶形成;(6)尼氏體染色、神經(jīng)功能學mNSS評分結果顯示:MSEC過表達促進神經(jīng)干細胞對MCAO保護作用;Nocodazol預處理削弱神經(jīng)干細胞對MCAO保護作用;(7)western blot檢測結果顯示:MSEC預處理神經(jīng)干細胞上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,降低促凋亡蛋白Bax和通路下游分子Cyt-c的表達;Nocodazole預處理結果則相反;(8)總體上,MSEC預處理神經(jīng)干細胞能促進抗氧化因素的作用,抑制H2O2、ROS、MDA等氧化因素;采用Nocodazole預處理神經(jīng)干細胞得到相反的結果。結論在本研究中,我們成功構建BMECs和NSCs共培養(yǎng)模型,驗證發(fā)現(xiàn)了BMECs和NSCs之間TNTs的形成。MSEC基因對TNTs形成有促進作用、Nocodazole預處理神經(jīng)干細胞會阻礙TNTs形成。TNT缺少特異性標記物,在細胞密度高的腦組織內(nèi)難以直接觀察。NSCs添加MSEC或Nocodazole預處理后,對MCAO模型進行移植治療時,TNT促進因素MSEC預處理神經(jīng)干細胞更能削弱細胞的線粒體凋亡、減弱氧化應激反應;TNT抑制因素Nocodazole預處理結果則相反。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R743.3
【圖文】：

米管形成及影響因素腦微血管內(nèi)皮細胞是一層薄的貼壁細胞,易受化學、物理和機械刺激影響,構血液和之間的可變形固體血管壁之間分界面[1]。在微觀層面,內(nèi)皮細胞(ECs)中央平細胞核細長。ECs 包含 Weibel-Palade 棒管狀小體,這是一種長桿狀的，存儲和分細胞器,可釋放血管性血友病因子和 P-選擇素等因子。血腦屏障(Blood-brain baBBB)的電子顯微鏡研究表明 BMECs 形態(tài)和代謝特征不同于其周圍組織[2]， BB神經(jīng)組織和血液成分之間的分界面[3],對大腦微環(huán)境進行調節(jié)以保證正常神經(jīng)活動利進行。BBB 由四個主要細胞元素（圖 1-1）,即大腦微血管內(nèi)皮細胞(BMECs)、膠質細胞終足、小膠質細胞和周細胞[4]。與外周微脈管系統(tǒng)不同的是，大腦微脈統(tǒng)(血管直徑< 20μm)不僅保持大腦的血液供應，也能促進神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞的信息傳遞[5]。經(jīng)過多年的研究,現(xiàn)在 BMECs 被認為不僅是一個簡單的解剖和生障,也是一個高度活躍的代謝系統(tǒng),合成各種物質以滋養(yǎng)神經(jīng)細胞、調節(jié)血管舒縮[6]。此外，BMEC 功能障礙可以觸發(fā)大腦組織損傷,如中風、創(chuàng)傷性腦損傷、神行性疾病，這些損傷通過反饋回路加劇 BMECs 功能障礙[7]。BMECs 的損傷在對

在生物安全柜中進行相關操作。11. Nocodazole 處理神經(jīng)干細胞我們選擇Nocodazole這種微管蛋白抑制劑，作為TNT形成抑制物，與其對照組進行分析。在共培養(yǎng)之前，將Nocodazole以5 10-8mol/L的終濃度加入共培養(yǎng)培養(yǎng)液中，并進一步孵育4小時。隨后將含有Nocodazole的培養(yǎng)液更換為正常DMEM/F12繼續(xù)培養(yǎng)24小時。12. NSCs 與 BMECs 共培體系我們選擇 NSCs 的完全培養(yǎng)液作為共培體系的基礎培養(yǎng)基（圖 1-2）。因為該實驗主要研究由神經(jīng)干細胞這種活力相對較強的細胞所發(fā)出的 TNT，BMECs 需要模擬一種細胞應激狀態(tài)，故采用原代培養(yǎng)傳代換液 6 代之后的 BMECs，同時進行培養(yǎng)基的血清剝奪，人為造成 BMECs 的相對 惡劣 條件，觀察神經(jīng)干細胞對其的 救助功能。共培時間設定為 24 小時，因為相關研究證實，24 小時左右 TNT 已經(jīng)形成，并相對較穩(wěn)定。

圖 1-3、神經(jīng)干細胞球鑒定圖 1-3：a ~ c. 神經(jīng)干細胞細胞球；d ~ e. 神經(jīng)干細胞爬出；a. d. 細胞核 DAPI 染色；b. e. 神經(jīng)干細胞標記物 Nestin 染色；c. f. 前兩者融合圖。Figure 1-3: The identification of neural stem cell globesa ~ c. Neural stem cell sphere; d ~ e. Neural stem cells climb out;a. d. Nuclear DAPI staining; b. e. neural stem cell marker Nestin staining; c. f. the first twofigures fusion.二、 腦微血管內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)與鑒定我們采用兩步酶解法對小鼠腦皮質的 BMECs 進行原代培養(yǎng)，純化血管段后可見如圖 1-4a 所示梭形或橢圓形 BMECs 構成的呈條索狀腦微血管片段；繼續(xù)培養(yǎng)可見BMECs 從貼壁的微血管段爬出，短條索狀，經(jīng)如上文實驗方法部分換液后殘余的雜質部分不斷減少，周細胞、成纖維細胞等非目的細胞比例越來越少。隨著培養(yǎng)時間的延長，內(nèi)皮細胞不斷爬出，大約一周時間，可見 BMECs 融合成

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本文編號：2746626