【摘要】：顱內(nèi)動(dòng)脈瘤是一種常見的腦血管疾病,人群患病率為3.2%~5.0%。隨著神經(jīng)影像技術(shù)的發(fā)展,越來越多的未破裂顱內(nèi)動(dòng)脈瘤被檢出。絕大多數(shù)未破裂動(dòng)脈瘤并不會(huì)表現(xiàn)出特殊癥狀,但一旦破裂則導(dǎo)致動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血,致死率極高,大約60%~70%的患者還未來得及就醫(yī)就已經(jīng)死亡,對(duì)人類的生命健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。對(duì)于偶然發(fā)現(xiàn)的未破裂顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者,大多數(shù)選擇通過外科干預(yù)來預(yù)防動(dòng)脈瘤破裂引起的嚴(yán)重后果。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的外科手術(shù)治療主要包括開顱夾閉和血管內(nèi)介入栓塞治療兩種方法,但無論是哪種方法,都存在相應(yīng)的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)及手術(shù)費(fèi)用高昂等一系列問題。因此,從研究顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)病的病理生理學(xué)機(jī)制入手,尋找顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的無創(chuàng)治療(如藥物治療)靶點(diǎn),預(yù)防或逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈瘤的進(jìn)展,成為目前研究的主要方向。越來越多的研究表明遺傳因素和表觀遺傳學(xué)因素可能在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用,其中,研究非編碼RNA的基因表達(dá)調(diào)控作用是探索顱內(nèi)動(dòng)脈瘤表觀遺傳學(xué)機(jī)制、尋找有效診斷和治療靶點(diǎn)的重要途經(jīng)。環(huán)狀RNA(circRNA)是一種新近發(fā)現(xiàn)的基因表達(dá)調(diào)控因子,它是一種通過特殊的反向剪接機(jī)制由線性RNA前體的5’端和3’端共價(jià)相接形成非編碼RNA,具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、序列保守、組織特異性和發(fā)育階段特異性的特點(diǎn)。目前已證實(shí)circRNA可通過“miRNA海綿”、結(jié)合RNA結(jié)合蛋白以及影響線性RNA剪接等方式發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控作用,而且越來越多研究證明其與臨床上的多種疾病密切相關(guān),包括心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和惡性腫瘤等。目前疾病相關(guān)circRNA的研究工作主要分為兩個(gè)方面,一是通過利用高通量測(cè)序或基因芯片技術(shù)檢測(cè)疾病相關(guān)的細(xì)胞或組織中circRNA表達(dá)水平,并利用生物信息學(xué)方法構(gòu)建和分析circRNA表達(dá)譜;二是通過各種實(shí)驗(yàn)方法研究circRNA在疾病中的生物學(xué)功能。迄今為止,尚無研究報(bào)道顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)的circRNA表達(dá)譜以及circRNA在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中的生物學(xué)功能。因此,我們進(jìn)行了本研究,從顱內(nèi)動(dòng)脈瘤circRNA表達(dá)譜的構(gòu)建、差異circRNA的表達(dá)驗(yàn)證以及關(guān)鍵circRNA的功能和機(jī)制探索三個(gè)方面開展,旨在研究circRNA在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤形成和破裂中的作用。第一部分顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)circRNA表達(dá)譜分析目的:構(gòu)建顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)circRNA表達(dá)譜,篩選差異表達(dá)基因并對(duì)其功能進(jìn)行預(yù)測(cè),為后續(xù)研究circRNA在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。方法:收集16例顱內(nèi)動(dòng)脈瘤(破裂動(dòng)脈瘤和未破裂動(dòng)脈瘤各8例)和8例顳淺動(dòng)脈組織樣本,提取總RNA并富集其中的circRNA,利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)組織的circRNA進(jìn)行檢測(cè),使用軟件進(jìn)行序列比對(duì)和注釋獲得circRNA表達(dá)譜;取差異倍數(shù)≥2倍且p0.05作為篩選差異circRNA的閾值,獲得差異表達(dá)的circRNA;然后對(duì)差異circRNA的宿主基因進(jìn)行GO分析和KEGG通路富集分析,以推測(cè)circRNA的功能。結(jié)果:在24個(gè)組織標(biāo)本中共獲得25,980個(gè)circRNA,經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析篩選出了顱內(nèi)動(dòng)脈瘤和顳淺動(dòng)脈對(duì)照之間、破裂動(dòng)脈瘤和未破裂動(dòng)脈瘤之間差異表達(dá)顯著的circRNA分別為1,054個(gè)和1,394個(gè),其中分別有782個(gè)和1,087個(gè)circRNA在兩種對(duì)比方式中呈下調(diào)表達(dá);差異表達(dá)circRNA宿主基因GO分析和KEGG分析結(jié)果顯示,發(fā)現(xiàn)它們可能參與了血管平滑肌細(xì)胞收縮、細(xì)胞骨架蛋白代謝以及TGF-β信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等多個(gè)生物學(xué)過程。結(jié)論:circRNA在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤與顳淺動(dòng)脈之間和破裂動(dòng)脈瘤與未破裂動(dòng)脈瘤之間差異表達(dá)明顯,差異表達(dá)的circRNA中多數(shù)為下調(diào)表達(dá),差異表達(dá)的circRNA功能與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤可能存在密切關(guān)聯(lián)。第二部分顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)差異circRNA驗(yàn)證及關(guān)鍵circRNA-miRNA相互作用預(yù)測(cè)目的:驗(yàn)證測(cè)序獲得的差異circRNA的表達(dá)水平,檢驗(yàn)差異circRNA的真實(shí)性,對(duì)關(guān)鍵circRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),為下一步功能研究提供基礎(chǔ)。方法:另外收集20例顱內(nèi)動(dòng)脈瘤(破裂動(dòng)脈瘤和未破裂動(dòng)脈瘤各10例)和16例顳淺動(dòng)脈組織樣本,設(shè)計(jì)circRNA特異性背靠背引物,選取顱內(nèi)動(dòng)脈瘤對(duì)比顳淺動(dòng)脈對(duì)照和破裂動(dòng)脈瘤對(duì)比未破裂動(dòng)脈瘤差異結(jié)果中上調(diào)和下調(diào)表達(dá)最顯著的外顯子來源circRNA各5個(gè),進(jìn)行qPCR檢測(cè)驗(yàn)證這些circRNA的表達(dá)差異;對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序,根據(jù)得到的序列中是否含有特異性反向剪接位點(diǎn)來驗(yàn)證qPCR結(jié)果的可靠性;利用RNase R消化來驗(yàn)證差異circRNA的穩(wěn)定性;選擇circSNX6作為研究對(duì)象,利用靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫對(duì)其進(jìn)行circRNA-miRNA-mRNA相互作用預(yù)測(cè),最后使用Cytoscape軟件繪制circRNA-miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果:qP CR檢測(cè)了20種cricRNA的表達(dá)水平,結(jié)果顯示10種circRNA表達(dá)水平有顯著差異,與測(cè)序結(jié)果一致,其余10種也表現(xiàn)出與測(cè)序結(jié)果相一致的表達(dá)趨勢(shì),但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;Sanger測(cè)序結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物準(zhǔn)確地包含特異性反向剪接位點(diǎn);RNase R消化后線性RNA對(duì)照表達(dá)量顯著下降,而各差異circRNA表達(dá)量保持相對(duì)穩(wěn)定;靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示circSNX6序列中存在hsa-miR-145-5p、hsa-miR-16-5p和hsa-miR-195-5p的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)論:顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)差異circRNA表達(dá)譜結(jié)果穩(wěn)定可靠,circSNX6可能通過結(jié)合hsa-miR-145-5p、hsa-miR-16-5p和hsa-miR-195-5p發(fā)揮作用。第三部分circSNX6在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中的功能和作用機(jī)制初步研究目的:初步探索circSNX6在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中的功能和作用機(jī)制。方法:根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果和circBase數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果分析circSNX6的序列特征。利用人腦血管平滑肌細(xì)胞(HBVSMC)作為研究對(duì)象,核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circSNX6的亞細(xì)胞定位。TNF-α刺激HBVSMC構(gòu)建平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化模型并檢測(cè)circSNX6的表達(dá)水平。構(gòu)建circSNX6過表達(dá)質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染HBVSMC,qPCR檢測(cè)過表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率;對(duì)HBVSMC過表達(dá)circSNX6,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力,CCK8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力,qPCR和Western blot檢測(cè)平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平;qPCR檢測(cè)circSNX6過表達(dá)后下游靶miRNA的表達(dá)量變化,分析與circSNX6負(fù)向調(diào)節(jié)表達(dá)的miRNA,推測(cè)其相互作用關(guān)系,最后利用starBase和miRanda分析序列結(jié)合的特異性。結(jié)果:circSNX6是一個(gè)由14號(hào)染色體上SNX6(NM_021249)基因中第2-8個(gè)外顯子首尾相連而成的circRNA,含有740個(gè)堿基。核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示circSNX6的亞細(xì)胞定位主要在細(xì)胞質(zhì)中。在平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化后circSNX6的表達(dá)水平顯著升高。circSNX6過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HBVSMC后circSNX6的表達(dá)水平明顯升高,細(xì)胞遷移和細(xì)胞增殖能力明顯提高,qPCR和Western blot結(jié)果顯示:收縮型平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物(α-SMA和calponin)表達(dá)下降,合成分泌型標(biāo)志物(MMP9)表達(dá)升高;過表達(dá)circSNX6后miR-195的表達(dá)水平顯著下降,提示miR-195可能受到circSNX6的負(fù)向調(diào)節(jié);circSNX6中與miR-195結(jié)合的序列類型為7mer-m8型,表現(xiàn)出較高的特異性。結(jié)論:circSNX6可通過影響平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化,參與動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展。circSNX6的功能可能通過抑制miR-195的功能介導(dǎo)。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R743
【圖文】：

圖 1-1：組織樣本 RNA 變性瓊脂糖凝膠電泳圖（二）顱內(nèi)動(dòng)脈瘤 circRNA 表達(dá)譜初步分析1、circRNA 表達(dá)譜基本概況每個(gè)組織樣本平均可檢測(cè)出近 8,000 萬個(gè)高質(zhì)量的原始讀數(shù)，其中 80 %以上能對(duì)到人類參考基因組上（表 1-3）；通過注釋，這些組織樣本共鑒定出 25,980 個(gè)NA，韋恩圖顯示三組樣本共同表達(dá)的 circRNA 有 4,679 個(gè)（圖 1-2）。

圖 1-1：組織樣本 RNA 變性瓊脂糖凝膠電泳圖脈瘤 circRNA 表達(dá)譜初步分析達(dá)譜基本概況均可檢測(cè)出近 8,000 萬個(gè)高質(zhì)量的原始讀數(shù)，因組上（表 1-3）；通過注釋，這些組織樣本共三組樣本共同表達(dá)的 circRNA 有 4,679 個(gè)（

圖 1-5：circRNA 染色體分布2、差異 circRNA 表達(dá)譜分析們對(duì)三組樣本通過兩種方式進(jìn)行比較分析：顱內(nèi)動(dòng)脈瘤 vs 對(duì)照組，破 未破裂動(dòng)脈瘤。通過統(tǒng)計(jì)分析，得出如下結(jié)果：（1）顱內(nèi)動(dòng)脈瘤 vs 對(duì)照著性差異的 circRNA 共有 1,054 個(gè)，其中動(dòng)脈瘤中上調(diào)表達(dá)的 272 個(gè)、782 個(gè)；（2）破裂動(dòng)脈瘤 vs 未破裂動(dòng)脈瘤：表達(dá)有顯著性差異的 circRN 個(gè)，其中破裂動(dòng)脈瘤中上調(diào)表達(dá)的 307 個(gè)、下調(diào)表達(dá)的 1,087 個(gè)。我們火山圖顯示出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05，差異倍數(shù)≥2.0）的差異表達(dá)的 c1-6，圖 1-7）。據(jù)各組樣本中 circRNA 表達(dá)分布不同，可將表達(dá)情況相近的樣本聚類到分析：我們用熱圖直觀的展示了各組樣本之間的 circRNA 表達(dá)分布特高低，樹狀圖顯示各組內(nèi)樣本關(guān)系密切且不同組別有明顯差異（圖 1-8

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本文編號(hào)：2745934