【摘要】：顱內動脈瘤是一種常見的腦血管疾病,人群患病率為3.2%~5.0%。隨著神經影像技術的發(fā)展,越來越多的未破裂顱內動脈瘤被檢出。絕大多數(shù)未破裂動脈瘤并不會表現(xiàn)出特殊癥狀,但一旦破裂則導致動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血,致死率極高,大約60%~70%的患者還未來得及就醫(yī)就已經死亡,對人類的生命健康構成嚴重威脅。對于偶然發(fā)現(xiàn)的未破裂顱內動脈瘤患者,大多數(shù)選擇通過外科干預來預防動脈瘤破裂引起的嚴重后果。顱內動脈瘤的外科手術治療主要包括開顱夾閉和血管內介入栓塞治療兩種方法,但無論是哪種方法,都存在相應的手術風險及手術費用高昂等一系列問題。因此,從研究顱內動脈瘤發(fā)病的病理生理學機制入手,尋找顱內動脈瘤的無創(chuàng)治療(如藥物治療)靶點,預防或逆轉動脈瘤的進展,成為目前研究的主要方向。越來越多的研究表明遺傳因素和表觀遺傳學因素可能在顱內動脈瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用,其中,研究非編碼RNA的基因表達調控作用是探索顱內動脈瘤表觀遺傳學機制、尋找有效診斷和治療靶點的重要途經。環(huán)狀RNA(circRNA)是一種新近發(fā)現(xiàn)的基因表達調控因子,它是一種通過特殊的反向剪接機制由線性RNA前體的5’端和3’端共價相接形成非編碼RNA,具有結構穩(wěn)定、序列保守、組織特異性和發(fā)育階段特異性的特點。目前已證實circRNA可通過“miRNA海綿”、結合RNA結合蛋白以及影響線性RNA剪接等方式發(fā)揮基因表達調控作用,而且越來越多研究證明其與臨床上的多種疾病密切相關,包括心腦血管疾病、神經系統(tǒng)疾病和惡性腫瘤等。目前疾病相關circRNA的研究工作主要分為兩個方面,一是通過利用高通量測序或基因芯片技術檢測疾病相關的細胞或組織中circRNA表達水平,并利用生物信息學方法構建和分析circRNA表達譜;二是通過各種實驗方法研究circRNA在疾病中的生物學功能。迄今為止,尚無研究報道顱內動脈瘤相關的circRNA表達譜以及circRNA在顱內動脈瘤中的生物學功能。因此,我們進行了本研究,從顱內動脈瘤circRNA表達譜的構建、差異circRNA的表達驗證以及關鍵circRNA的功能和機制探索三個方面開展,旨在研究circRNA在顱內動脈瘤形成和破裂中的作用。第一部分顱內動脈瘤相關circRNA表達譜分析目的:構建顱內動脈瘤相關circRNA表達譜,篩選差異表達基因并對其功能進行預測,為后續(xù)研究circRNA在顱內動脈瘤中的生物學作用奠定基礎。方法:收集16例顱內動脈瘤(破裂動脈瘤和未破裂動脈瘤各8例)和8例顳淺動脈組織樣本,提取總RNA并富集其中的circRNA,利用高通量測序技術對組織的circRNA進行檢測,使用軟件進行序列比對和注釋獲得circRNA表達譜;取差異倍數(shù)≥2倍且p0.05作為篩選差異circRNA的閾值,獲得差異表達的circRNA;然后對差異circRNA的宿主基因進行GO分析和KEGG通路富集分析,以推測circRNA的功能。結果:在24個組織標本中共獲得25,980個circRNA,經過統(tǒng)計分析篩選出了顱內動脈瘤和顳淺動脈對照之間、破裂動脈瘤和未破裂動脈瘤之間差異表達顯著的circRNA分別為1,054個和1,394個,其中分別有782個和1,087個circRNA在兩種對比方式中呈下調表達;差異表達circRNA宿主基因GO分析和KEGG分析結果顯示,發(fā)現(xiàn)它們可能參與了血管平滑肌細胞收縮、細胞骨架蛋白代謝以及TGF-β信號通路、MAPK信號通路等多個生物學過程。結論:circRNA在顱內動脈瘤與顳淺動脈之間和破裂動脈瘤與未破裂動脈瘤之間差異表達明顯,差異表達的circRNA中多數(shù)為下調表達,差異表達的circRNA功能與顱內動脈瘤可能存在密切關聯(lián)。第二部分顱內動脈瘤相關差異circRNA驗證及關鍵circRNA-miRNA相互作用預測目的:驗證測序獲得的差異circRNA的表達水平,檢驗差異circRNA的真實性,對關鍵circRNA進行靶基因預測,為下一步功能研究提供基礎。方法:另外收集20例顱內動脈瘤(破裂動脈瘤和未破裂動脈瘤各10例)和16例顳淺動脈組織樣本,設計circRNA特異性背靠背引物,選取顱內動脈瘤對比顳淺動脈對照和破裂動脈瘤對比未破裂動脈瘤差異結果中上調和下調表達最顯著的外顯子來源circRNA各5個,進行qPCR檢測驗證這些circRNA的表達差異;對PCR產物進行Sanger測序,根據(jù)得到的序列中是否含有特異性反向剪接位點來驗證qPCR結果的可靠性;利用RNase R消化來驗證差異circRNA的穩(wěn)定性;選擇circSNX6作為研究對象,利用靶基因預測數(shù)據(jù)庫對其進行circRNA-miRNA-mRNA相互作用預測,最后使用Cytoscape軟件繪制circRNA-miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡圖。結果:qP CR檢測了20種cricRNA的表達水平,結果顯示10種circRNA表達水平有顯著差異,與測序結果一致,其余10種也表現(xiàn)出與測序結果相一致的表達趨勢,但未達到統(tǒng)計學差異;Sanger測序結果顯示PCR擴增產物準確地包含特異性反向剪接位點;RNase R消化后線性RNA對照表達量顯著下降,而各差異circRNA表達量保持相對穩(wěn)定;靶基因預測結果顯示circSNX6序列中存在hsa-miR-145-5p、hsa-miR-16-5p和hsa-miR-195-5p的結合位點。結論:顱內動脈瘤相關差異circRNA表達譜結果穩(wěn)定可靠,circSNX6可能通過結合hsa-miR-145-5p、hsa-miR-16-5p和hsa-miR-195-5p發(fā)揮作用。第三部分circSNX6在顱內動脈瘤中的功能和作用機制初步研究目的:初步探索circSNX6在顱內動脈瘤中的功能和作用機制。方法:根據(jù)高通量測序結果和circBase數(shù)據(jù)庫檢索結果分析circSNX6的序列特征。利用人腦血管平滑肌細胞(HBVSMC)作為研究對象,核質分離實驗檢測circSNX6的亞細胞定位。TNF-α刺激HBVSMC構建平滑肌細胞表型轉化模型并檢測circSNX6的表達水平。構建circSNX6過表達質粒,并轉染HBVSMC,qPCR檢測過表達質粒的轉染效率;對HBVSMC過表達circSNX6,細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力,CCK8法檢測細胞的增殖能力,qPCR和Western blot檢測平滑肌細胞表型轉化相關標志物的表達水平;qPCR檢測circSNX6過表達后下游靶miRNA的表達量變化,分析與circSNX6負向調節(jié)表達的miRNA,推測其相互作用關系,最后利用starBase和miRanda分析序列結合的特異性。結果:circSNX6是一個由14號染色體上SNX6(NM_021249)基因中第2-8個外顯子首尾相連而成的circRNA,含有740個堿基。核質分離實驗結果顯示circSNX6的亞細胞定位主要在細胞質中。在平滑肌細胞表型轉化后circSNX6的表達水平顯著升高。circSNX6過表達載體轉染HBVSMC后circSNX6的表達水平明顯升高,細胞遷移和細胞增殖能力明顯提高,qPCR和Western blot結果顯示:收縮型平滑肌細胞標志物(α-SMA和calponin)表達下降,合成分泌型標志物(MMP9)表達升高;過表達circSNX6后miR-195的表達水平顯著下降,提示miR-195可能受到circSNX6的負向調節(jié);circSNX6中與miR-195結合的序列類型為7mer-m8型,表現(xiàn)出較高的特異性。結論:circSNX6可通過影響平滑肌細胞的表型轉化,參與動脈瘤的發(fā)生發(fā)展。circSNX6的功能可能通過抑制miR-195的功能介導。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R743
【圖文】：

圖 1-1：組織樣本 RNA 變性瓊脂糖凝膠電泳圖（二）顱內動脈瘤 circRNA 表達譜初步分析1、circRNA 表達譜基本概況每個組織樣本平均可檢測出近 8,000 萬個高質量的原始讀數(shù)，其中 80 %以上能對到人類參考基因組上（表 1-3）；通過注釋，這些組織樣本共鑒定出 25,980 個NA，韋恩圖顯示三組樣本共同表達的 circRNA 有 4,679 個（圖 1-2）。

圖 1-1：組織樣本 RNA 變性瓊脂糖凝膠電泳圖脈瘤 circRNA 表達譜初步分析達譜基本概況均可檢測出近 8,000 萬個高質量的原始讀數(shù)，因組上（表 1-3）；通過注釋，這些組織樣本共三組樣本共同表達的 circRNA 有 4,679 個（

圖 1-5：circRNA 染色體分布2、差異 circRNA 表達譜分析們對三組樣本通過兩種方式進行比較分析：顱內動脈瘤 vs 對照組，破 未破裂動脈瘤。通過統(tǒng)計分析，得出如下結果：（1）顱內動脈瘤 vs 對照著性差異的 circRNA 共有 1,054 個，其中動脈瘤中上調表達的 272 個、782 個；（2）破裂動脈瘤 vs 未破裂動脈瘤：表達有顯著性差異的 circRN 個，其中破裂動脈瘤中上調表達的 307 個、下調表達的 1,087 個。我們火山圖顯示出有統(tǒng)計學意義（p<0.05，差異倍數(shù)≥2.0）的差異表達的 c1-6，圖 1-7）。據(jù)各組樣本中 circRNA 表達分布不同，可將表達情況相近的樣本聚類到分析：我們用熱圖直觀的展示了各組樣本之間的 circRNA 表達分布特高低，樹狀圖顯示各組內樣本關系密切且不同組別有明顯差異（圖 1-8

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本文編號：2745934