發(fā)布時(shí)間：2020-07-07 05:50

【摘要】：背景膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma,GBM)是顱內(nèi)常見的原發(fā)性惡性腫瘤,起源于神經(jīng)上皮細(xì)胞。目前主要的治療途徑是手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后放化療,但預(yù)后較差,生存率較低。主要原因一方面是腫瘤呈浸潤性生長且大多處于顱內(nèi)重要部位,手術(shù)往往不能徹底切除;另一方面是化療藥物難以跨過血腦屏障到達(dá)腫瘤部位且單一藥物治療效果較差。因此,新的治療策略亟待研究,聯(lián)合應(yīng)用兩種或多種藥物并靶向遞送到腫瘤部位成為腫瘤治療策略研究的熱點(diǎn)。姜黃素(Curcumin,CUR)是從植物姜黃中提取的黃色多酚類天然活性物質(zhì),研究表明CUR具有增敏、抗炎、抗癌等多種藥理作用,其中抗癌作用已在動物實(shí)驗(yàn)中得到反復(fù)驗(yàn)證,但較差的水溶性限制了其應(yīng)用;阿霉素(Doxorubicin,DOX)是臨床常用廣譜抗腫瘤藥物,存在治療窗短,耐藥性強(qiáng),心臟毒性大等問題,有研究證實(shí)DOX與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用能夠提高其抗腫瘤效果并逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。隨著納米醫(yī)學(xué)的出現(xiàn),納米結(jié)構(gòu)的物理和化學(xué)性質(zhì)與藥物有效遞送到腫瘤細(xì)胞的能力的關(guān)系被闡明,納米載藥系統(tǒng)因其能夠提高藥物利用率,增加藥物水溶性,延長藥物體內(nèi)循環(huán)時(shí)間,實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向及藥物共遞送等優(yōu)點(diǎn)受到關(guān)注,使用納米載藥復(fù)合物已成為神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤診治的潛在策略。有研究證明通過納米顆粒(Nanoparticles,NPs)共遞送不同藥物能夠有效提高藥物療效并實(shí)現(xiàn)藥物協(xié)同作用,具有廣闊的應(yīng)用前景。近幾年,有文獻(xiàn)報(bào)道將化療藥物包載入NPs中可以顯著增強(qiáng)抗膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的效果,但不同類型納米顆粒及化療藥物作用于不同腫瘤的效果具有一定差別,優(yōu)良的制備方案及合適的診療策略仍亟待研究。本文采用薄膜水化法利用聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)包裹CUR和DOX自組裝制備出共載DOX和CUR的納米膠束PEG/DOX/CUR,并探討了DOX和CUR協(xié)同作用、PEG/DOX/CUR抗膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的作用及其進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制。目的探討PEG/DOX/CUR體外抗膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的作用、DOX和CUR的協(xié)同作用及細(xì)胞攝取PEG/DOX/CUR的機(jī)制。方法1.制備并表征PEG/DOX/CUR。根據(jù)單因素考察法篩選出PEG/DOX/CUR的最優(yōu)制備方法。利用掃描電子顯微鏡、粒徑電勢掃描儀、熒光分光光度計(jì)、核磁共振波譜儀等對PEG/DOX/CUR進(jìn)行表征;利用透析袋模擬體內(nèi)釋放環(huán)境,測定DOX和CUR從PEG/DOX/CUR中釋放的效率;通過調(diào)節(jié)pH,模擬腫瘤組織環(huán)境,研究PEG/DOX/CUR在酸性環(huán)境中釋放DOX和CUR效率;2.研究DOX和CUR的協(xié)同作用及PEG/DOX/CUR抗膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的作用。通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞存活率,利用公式計(jì)算半數(shù)抑制濃度(50%Inhibiting concentration,IC50)及藥物聯(lián)合作用指數(shù)(Combination index,CI);通過鈣黃綠素(Calcein,CA)/碘化丙啶(Propidium iodide,PI)雙染實(shí)驗(yàn)檢測PEG/DOX/CUR的促細(xì)胞凋亡作用;通過劃痕實(shí)驗(yàn)研究PEG/DOX/CUR抑制細(xì)胞遷移的能力;3.探究PEG/DOX/CUR細(xì)胞攝取機(jī)制。利用共聚焦超分辨顯微鏡觀察PEG/DOX/CUR的細(xì)胞內(nèi)化;利用流式細(xì)胞儀量化分析細(xì)胞攝取效率;通過抑制細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)通道研究PEG/DOX/CUR進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制。結(jié)果1.成功構(gòu)建了雙載納米膠束PEG/DOX/CUR。投藥濃度為0.5 mg/mL,投藥比DOX:CUR:PEG為1:1:7,使用薄膜水化法構(gòu)建的PEG/DOX/CUR粒徑最小,平均粒徑約60nm,多分散系數(shù)(Polydispersity index,PDI)小于0.2,Zeta電位約-47 mV,DOX與CUR包封率均大于90%,載藥量約為8%,PEG/DOX/CUR穩(wěn)定性良好;雙載納米膠束PEG/DOX/CUR具有緩慢釋藥的效果,體外釋放結(jié)果表明PEG/DOX/CUR中DOX和CUR呈現(xiàn)緩慢釋放現(xiàn)象,且在酸性環(huán)境中DOX和CUR釋放較快;2.雙載納米膠束PEG/DOX/CUR具有抗膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的作用。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DOX和CUR聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用,空白NPs對細(xì)胞無明顯毒性,PEG/DOX/CUR能夠有效地促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞遷移,不同濃度的PEG/DOX/CUR均具有協(xié)同抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的作用;3.雙載納米膠束PEG/DOX/CUR主要通過小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PEG/DOX/CUR能夠有效地進(jìn)入細(xì)胞且具有時(shí)間、能量依賴性,表明雙載納米膠束PEG/DOX/CUR主要通過內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞;內(nèi)吞途徑實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PEG/DOX/CUR主要通過小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞。結(jié)論成功構(gòu)建了PEG/DOX/CUR,粒徑小,穩(wěn)定性好且具有緩慢釋放的特性;PEG/DOX/CUR具有抗膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的作用且DOX和CUR具有協(xié)同作用;PEG/DOX/CUR進(jìn)入細(xì)胞的途徑主要是小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.41
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 PEG/DOX/CUR 制備及表征3.1.1 紫外分光光度計(jì)測定 DOX 含量方法的確定紫外光譜顯示 DOX 最大吸收峰位于 500 nm 處，特征性檢測結(jié)果顯示，在 500 nm 處CUR 及空白 NPs 對阿霉素的吸收無干擾，所以選擇 500 nm 作為 DOX 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定波長。以 500 nm 處 DOX 的吸光度為縱坐標(biāo)，DOX 的濃度為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示線性關(guān)系良好。Y=0.01487 x+0.06196，R2=0.9999.

圖 2 CUR 含量測定方法的確定。a是 CUR熒光光譜；b 是 CUR專屬性熒光光譜；c 是 CUR濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.1.3 PEG/DOX/CUR 的制備表 1 是利用納米沉淀法、透析法、薄膜水化法制備的 PEG/DOX/CUR 的各項(xiàng)參數(shù)，結(jié)果顯示使用不同制備方法得到的 PEG/DOX/CUR的電位、分散系數(shù)及 DOX和 CUR的包封率無明顯差異，薄膜水化法制備得到的 PEG/DOX/CUR 粒徑最小，因此，選用薄膜水化法制備 PEG/DOX/CUR；表 2 是采用不同投料比制備的 PEG/DOX/CUR，結(jié)果顯示隨著 PEG用量增多，PEG/DOX/CUR粒徑、分散系數(shù)逐漸降低，包封率逐漸增高；投料比為1:1:7和1:1:8 時(shí)，粒徑、電位及包封率基本無差別，但 1:1:8 的投料比制備的 PEG/DOX/CUR PDI較大，可能是由于過多的 PEG形成了未包裹藥物的較小空白納米顆粒，增大了 PDI，另外，增加 PEG 用量也存在毒性增加的風(fēng)險(xiǎn)，因此，本研究選取 1:1:7 的投料比進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；表 3 為投藥濃度對 PEG/DOX/CUR 制備的影響，結(jié)果顯示，投藥濃度為 0.5 mg/mL時(shí)各項(xiàng)

圖 3 核磁氫譜。a為 CUR核磁氫譜，b 為 DOX核磁氫譜；c 為 PEG/DOX/CUR 核磁氫譜。3.1.5 PEG/DOX/CUR 紫外及熒光光譜圖 4是 PEG/DOX/CUR 的紫外及熒光光譜，結(jié)果顯示包載了 CUR 和 DOX的PEG/DOX/CUR 在 500 nm-600 nm 處有一個(gè)較寬的熒光發(fā)射峰，是 CUR 和 DOX 內(nèi)在熒光性質(zhì)所致，為直接使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞攝取及內(nèi)吞機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：2744733