【摘要】：實(shí)驗(yàn)背景神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathic pain,NP)是由于神經(jīng)系統(tǒng)損害或神經(jīng)功能障礙引起的一種慢性疼痛�；颊唛L期處于疼痛狀態(tài)會(huì)使焦慮和抑郁率的發(fā)生率增加。目前對(duì)NP的發(fā)病機(jī)制研究仍處于探索階段,臨床可用藥物的治療效果有限且大多伴有明顯的副作用,其中帶狀皰疹后神經(jīng)疼痛較為典型。既往研究認(rèn)為NP的發(fā)生主要與中樞敏化和外周敏化有關(guān)。神經(jīng)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中產(chǎn)生的NF-κB、促炎因子以及膠質(zhì)細(xì)胞的活化參與NP過程。研究發(fā)現(xiàn)缺血性卒中的神經(jīng)損傷使神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白2(Ninjurin 2,NINJ 2)表達(dá)高度上調(diào);體外培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)NINJ 2蛋白在周圍神經(jīng)損傷后遠(yuǎn)端神經(jīng)節(jié)的施萬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),并且通過神經(jīng)元軸突和施萬細(xì)胞之間的嗜同性細(xì)胞相互作用在背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中促進(jìn)神經(jīng)突向外生長;也有研究表明NINJ 2蛋白可能是內(nèi)皮炎癥和激活的新型調(diào)節(jié)劑,在血管內(nèi)皮細(xì)胞活化和炎癥中具有促炎作用。但尚未見相關(guān)研究探討NINJ 2蛋白與神經(jīng)病理性疼痛的相關(guān)性。因此,本實(shí)驗(yàn)展開研究,探討NINJ 2蛋白與神經(jīng)病理性疼痛的關(guān)系及其相關(guān)分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)擬采用大鼠坐骨神經(jīng)分支部分損傷模型(Spared Nerve Injury,SNI),運(yùn)用Western-blot技術(shù)觀察SNI大鼠脊髓中NINJ 2蛋白和NF-κB的表達(dá),采用免疫熒光雙染的技術(shù)觀察SNI大鼠脊髓內(nèi)NINJ 2蛋白是否與NF-κB和神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生共表達(dá)。利用鞘內(nèi)注射慢病毒技術(shù)干擾NINJ 2蛋白的表達(dá),觀察其對(duì)SNI大鼠疼痛行為學(xué)的影響,以及脊髓中NF-κB和促炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的表達(dá)變化。研究NINJ 2蛋白與NP的關(guān)系以及可能存在的作用機(jī)制,探索神經(jīng)病理性疼痛治療新靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)方法1.雄性SD大鼠隨機(jī)分為兩組:模型組(SNI組,n=8)和假手術(shù)組(Sham組,n=8),分別在術(shù)前3d、1d及術(shù)后1d、3d、5d、7d、10d、14d連續(xù)測量大鼠術(shù)側(cè)后足機(jī)械性縮足閾值(Paw withdrawal threshoid,PWT)。2.雄性SD大鼠隨機(jī)分為兩組:模型組(SNI組,n=15)和假手術(shù)組(Sham組,n=12)。分別在術(shù)前和術(shù)后3d、7d、14d取術(shù)側(cè)大鼠脊髓,采用Western-blot技術(shù)測脊髓內(nèi)NINJ 2蛋白、NF-κB的表達(dá)水平。在術(shù)后14d取大鼠脊髓,用免疫熒光雙染技術(shù)檢測脊髓中NINJ 2蛋白是否和NF-κB以及神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生共表達(dá)。3.雄性SD大鼠隨機(jī)分為四組:Sham+saline組(n=8),SNI+saline組(n=8),SNI+siRNA組(n=8)和SNI+scrRNA組(n=8)。分別進(jìn)行鞘內(nèi)置管術(shù)后鞘內(nèi)注射對(duì)應(yīng)的藥物,再過1周后手術(shù)建模。分別在術(shù)前3d、1d及術(shù)后1d、3d、5d、7d、10d、14d測術(shù)側(cè)大鼠行為學(xué)表現(xiàn)(PWT)。術(shù)后14d取各組大鼠脊髓,用Western-blot技術(shù)檢測NINJ 2蛋白和NF-κB的表達(dá)水平;用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測促炎癥細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.SNI手術(shù)引起大鼠痛覺過敏現(xiàn)象SNI術(shù)后大鼠術(shù)側(cè)后足產(chǎn)生機(jī)械性痛覺過敏。疼痛行為學(xué)結(jié)果顯示術(shù)前兩組大鼠基礎(chǔ)PWT比較未見顯著差異;術(shù)后3d SNI組大鼠PWT開始發(fā)生明顯下降,在術(shù)后7d降至最低,并持續(xù)到術(shù)后14d。SNI術(shù)后大鼠的PWT出現(xiàn)明顯下降,證明SNI大鼠可產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛,該模型建造成功。2.SNI術(shù)后大鼠脊髓中NINJ 2蛋白和NF-κB表達(dá)上調(diào);脊髓內(nèi)NINJ2蛋白與神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物NeuN和NF-κB發(fā)生共表達(dá)Western-blot結(jié)果顯示,SNI組術(shù)后3d、7d、14d大鼠術(shù)側(cè)脊髓中NINJ 2蛋白和NF-κB表達(dá)水平升高,以術(shù)后第7d表達(dá)水平為最高,蛋白表達(dá)水平與疼痛行為學(xué)變化呈一定相關(guān)性,NF-κB的變化趨勢與NINJ 2蛋白變化趨勢接近;Sham組大鼠脊髓的NINJ 2蛋白和NF-κB表達(dá)水平未見顯著改變。進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色后發(fā)現(xiàn),NINJ2蛋白與神經(jīng)元標(biāo)志物-NeuN和NF-κB發(fā)生共表達(dá)。3.鞘內(nèi)注射慢病毒干擾NINJ 2蛋白表達(dá)影響SNI大鼠疼痛行為學(xué),調(diào)控SNI大鼠脊髓中NINJ2蛋白、NF-kB、促炎因子的表達(dá)PWT結(jié)果顯示,鞘內(nèi)注射NINJ 2 siRNA干擾NINJ 2蛋白表達(dá)可以顯著升高SNI大鼠PWT水平,術(shù)后3d、5d、7d、10d、14d SNI+siRNA組大鼠PWT均出現(xiàn)上升。術(shù)后14d天取大鼠脊髓,Western-blot結(jié)果顯示,與SNI+Saline組相比,慢病毒干擾NINJ 2蛋白使SNI大鼠脊髓內(nèi)NINJ 2蛋白和NF-κB表達(dá)水平均下降(P0.05),說明NINJ 2蛋白可能調(diào)控NP中NF-κB的表達(dá)。ELISA結(jié)果顯示,與SNI+Saline組相比,SNI+siRNA組炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平明顯下調(diào),表明NINJ 2蛋白在NP中起促炎作用。結(jié)論上述結(jié)果提示大鼠坐骨神經(jīng)選擇性損傷可引起大鼠脊髓NINJ 2蛋白的表達(dá)上調(diào),NINJ 2蛋白可能通過調(diào)控NF-κB、促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)參與神經(jīng)病理性疼痛。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R741
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果坐骨神經(jīng)部分損傷模型（SNI）引起大鼠痛組大鼠從術(shù)前 3d 開始到手術(shù)后 14d 疼痛行為學(xué)的變化。前 3d 和術(shù)后 1d 兩組術(shù)側(cè)基礎(chǔ) PWT 比較無顯著差異（P相比，Sham 組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的 PWT 變化無明顯差異術(shù)側(cè)后足從術(shù)后 3d 開始 PWT 出現(xiàn)顯著下降趨勢，在術(shù)后到術(shù)后 14d（P＜0.05）。結(jié)果表明: SNI 模型可引起大鼠覺過敏，成功建立 SNI 模型。（見圖 1）

F-κB 的表達(dá)與術(shù)前相比未見增加（P＞0.05）。SNI 組大鼠F-κB 的表達(dá)量明顯增加。與 Sham 組相比，SNI 組大鼠脊在術(shù)后 3d 出現(xiàn)增加，可持續(xù)至術(shù)后 14d，術(shù)后 7d 蛋白表）。與 Sham 組相比，SNI 組大鼠脊髓中 NF-κB 的表達(dá)量從持續(xù)至術(shù)后 14d，術(shù)后 7d 表達(dá)量達(dá)最高（P＜0.05），接勢。上述結(jié)果說明，NINJ 2 蛋白和 NF-κB 參與神經(jīng)病理程，且 NF-κB 與 NINJ 2 蛋白可能存在一定的相關(guān)性。（

2.2 SNI 模型建立后各時(shí)間點(diǎn)大鼠脊髓 NF-κB（p-p65）的表達(dá)情 結(jié)果顯示 SNI 引起大鼠脊髓中 NF-κB（p-p65）表達(dá)上調(diào)，術(shù)后 7比，*P＜0.05光雙染結(jié)果回示，SNI 術(shù)后大鼠脊髓內(nèi) NINJ 2 蛋白與神共表達(dá)，與 Iba-1（小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物）和 GFAP（星形發(fā)生共表達(dá)；此外，NINJ2 蛋白還可以和 NF-κB 發(fā)生共表

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本文編號(hào)：2743482