【摘要】：目的1.采用原子力顯微鏡分子級(jí)成像技術(shù)從單分子水平研究神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)鍵蛋白survivin與抗體的相互作用,在接近蛋白自然條件下揭示其三維結(jié)構(gòu)和作用域,以便我們更直觀理解survivin在膠質(zhì)瘤發(fā)生和神經(jīng)損傷恢復(fù)中的分子作用機(jī)制及作用。2.選取腫瘤細(xì)胞凋亡抑制蛋白survivin,在近生理環(huán)境中使之與稀土離子鈰(Ce~(3+))發(fā)生作用;再通過(guò)原子力顯微鏡(AFM)對(duì)目標(biāo)物的精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像;實(shí)現(xiàn)在單分子水平上研究稀土小分子與目標(biāo)物的作用域。揭示稀土對(duì)抑制凋亡關(guān)鍵蛋白的作用方式與腫瘤細(xì)胞凋亡間的內(nèi)在聯(lián)系。方法1.選取survivin蛋白,高純水稀釋至0.2 ng/mL,survivin兔多克隆抗體稀釋至400 ng/mL,取5μL 0.04 ng/mL的survivin蛋白滴到新剝離的云母片上靜置制樣后用AFM觀測(cè);取5μL 40 ng/mL的survivin兔多克隆抗體滴到云母片上靜置制樣后用AFM觀測(cè);用微量移液器取20μL 0.2ng/mL的survivin蛋白,取10μL 400 ng/mL的survivin抗體,加70μL高純水稀釋后,振搖2 min后分別在25℃,37℃,45℃下孕育相應(yīng)時(shí)間后,取5μL survivin蛋白和survivin抗體的混合液滴到云母片上靜置制樣后用AFM觀測(cè)。樣品檢測(cè)都采用AFM的敲擊模式。2.選取survivin蛋白,高純水稀釋至0.2 ng/mL,選取鈰標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋至100μg/mL和10μg/mL,用微量移液器取5μL 0.02 ng/mL的survivin蛋白滴到新剝離的云母片上靜置制樣后用AFM觀測(cè);取5μL 10μg/mL的Ce~(3+)水溶液滴到新剝離的云母片上靜置制樣后用AFM觀測(cè);用微量移液器取10μL 0.2 ng/mL的survivin蛋白,用微量移液器取相應(yīng)體積的100μg/mL或10μg/mL的Ce~(3+)水溶液,加適量高純水稀釋后,配成所需濃度的溶液,振搖2 min后分別在25℃,37℃,45℃下孕育相應(yīng)時(shí)間后,用微量移液器取5μL survivin蛋白和Ce~(3+)的混合液滴到新剝離的云母片上靜置制樣后用AFM觀測(cè);樣品檢測(cè)都采用AFM的敲擊模式。結(jié)果1.對(duì)survivin蛋白同源二聚體的原子力顯微鏡觀測(cè)表明:在水溶液中survivin蛋白主要以7-8 nm大小的分散體存在,高分辨AFM圖可以清晰地看到survivin蛋白的結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)α螺旋。2.抗體三維結(jié)構(gòu)的高分辨AFM圖像表明:Y形結(jié)構(gòu)的IgG分布在球狀結(jié)構(gòu)的牛血清白蛋白之中,在AFM圖中二者可以通過(guò)結(jié)構(gòu)差異很容易區(qū)分。高分辨AFM圖揭示IgG的三個(gè)相對(duì)獨(dú)立并且有柔性鏈鏈接的Y型復(fù)合結(jié)構(gòu),可以獲得Ig G更細(xì)節(jié)的結(jié)構(gòu)域。3.溫度對(duì)survivin蛋白與survivin蛋白抗體相互作用的影響不同,25℃時(shí)survivin-抗體結(jié)合單元的三區(qū)域組合成的Y形結(jié)構(gòu)和球形或心形的粒子;37℃時(shí)除了可以發(fā)現(xiàn)Y形survivin-抗體結(jié)合單元外,還有單個(gè)的球形BSA;45℃時(shí)很多長(zhǎng)短不同的鏈狀結(jié)構(gòu)大量出現(xiàn),單個(gè)BSA蛋白的結(jié)構(gòu)也變得松散。高分辨AFM圖表明在45℃下,survivin-抗體結(jié)合單元只有局部還保持二級(jí)結(jié)構(gòu),整體已經(jīng)成為鏈狀,周圍分布了各種長(zhǎng)短的鏈狀結(jié)構(gòu)。4.溫度對(duì)survivin蛋白結(jié)構(gòu)的影響不同,25℃下蛋白團(tuán)聚比較嚴(yán)重;37℃下6-8 nm大小的粒子明顯增多,小粒子和大粒子數(shù)目明顯減少;45℃下溶液中5-12 nm粒子總數(shù)減少明顯,且不再看到溶液中有大于15 nm的大粒子存在,粒子間邊界比較明顯,蛋白有破損,有鏈狀結(jié)構(gòu)形成;37℃下survivin蛋白更多以6-8 nm的雙粒子結(jié)合體形式存在;45℃下Ce~(3+)在云母片上形成10 nm左右的大小均勻,邊緣光滑的結(jié)晶形結(jié)構(gòu)。5.不同Ce~(3+)濃度對(duì)survivin蛋白結(jié)構(gòu)的影響不同,37℃下survivin蛋白在水溶液中大部分得到均勻分散,粒子的邊緣能觀察到伸出的側(cè)鏈結(jié)構(gòu),經(jīng)過(guò)1μg/mL的Ce~(3+)作用后,粒子聚集為更大一些的較為均勻的粒子,粒子的邊緣具有類似絨毛的側(cè)鏈結(jié)構(gòu);經(jīng)過(guò)5μg/mL的Ce~(3+)作用后的粒子總數(shù)增多,一些更的大粒子開(kāi)始出現(xiàn),粒子邊緣開(kāi)始變平滑,類似絨毛的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)不再清晰,10μg/mL的Ce~(3+)作用后的survivin蛋白粒子繼續(xù)變大,粒子邊緣更為平滑緊致,小粒子變得松散,有少量的線裝肽段出現(xiàn);50μg/mL的Ce~(3+)作用后有更大的粒子組合形成,基底出現(xiàn)規(guī)則的硝酸鈰結(jié)晶的堆集。6.Ce~(3+)與survivin蛋白作用不同時(shí)間和不同溫度對(duì)其結(jié)構(gòu)的影響不同,survivin蛋白與Ce~(3+)在25℃下作用10 min后,在水溶液中形成大小不等的粒子,作用20 min后,在水溶液中8-10 nm大小的粒子明顯增多,超過(guò)5-9 nm的粒子占據(jù)主要地位,20-30 nm的團(tuán)聚也有所增多,作用30 min后形成了更多的形態(tài)各異的大的組合,有的超過(guò)60 nm,在37℃下作用10,20和30 min后具有類似的變化,在45℃下隨著作用時(shí)間的增加,聚合增多,并伴隨結(jié)構(gòu)的改變和破碎肽段的出現(xiàn)。結(jié)論1.適宜溫度對(duì)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)保持的重要性,結(jié)果表明survivin蛋白與抗體的結(jié)合在37℃比較適宜,這樣既能防止低溫下的團(tuán)聚作用又能避免高溫對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞。2.低溫對(duì)survivin蛋白大團(tuán)聚的分散不利,低溫有助于保持survivin蛋白以單體的形式存在,不利于二聚體的快速形成。較高的溫度能快速分散原來(lái)存在的團(tuán)聚物,但其副作用是對(duì)survivin蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)有一定程度的破壞,三級(jí)結(jié)構(gòu)展開(kāi)成肽鏈。在37℃接近生理?xiàng)l件的環(huán)境下,這兩種影響能更好的得到平衡。3.低濃度Ce~(3+)對(duì)survivin蛋白功能有兩個(gè)方面的影響:一是通過(guò)四聚體的形成減少溶液中survivin蛋白的密度,二是通過(guò)使溶液中的survivin二聚體解聚為survivin單體減少溶液中survivin蛋白的有效密度,高濃度Ce~(3+)對(duì)survivin蛋白功能的影響主要是抑制和損壞:除了通過(guò)聚合作用減少溶液中survivin蛋白的有效密度,還存在對(duì)其功能域的改變和破壞。4.時(shí)間的影響表現(xiàn)在:隨時(shí)間的增加,Ce~(3+)連接survivin蛋白二聚體成為更大的結(jié)構(gòu),多聚體數(shù)量增加。溫度影響表現(xiàn)在兩方面:一方面溫度能加速Ce~(3+)對(duì)survivin蛋白的聚合過(guò)程,另一方面溫度能增加Ce~(3+)對(duì)survivin蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變和破壞作用。較低溫度下以survivin蛋白二聚體向survivin蛋白多聚體轉(zhuǎn)化為主;在近生理溫度下,一方面也存在上述的這種單向聚合過(guò)程,而且這種過(guò)程由于溫度的適宜變得更快,在短時(shí)間內(nèi)能完成survivin蛋白二聚體向多聚體的轉(zhuǎn)變,除此之外還存在Ce~(3+)對(duì)survivin蛋白結(jié)構(gòu)的改變和survivin蛋白多聚體的解聚;在較高溫度下,Ce~(3+)不僅能改變survivin蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu),而且能對(duì)肽鏈造成損壞,使之部分成為肽段。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.4
【圖文】：

29第一部分 附圖圖1.1. 溶液中的survivin蛋白二聚體結(jié)構(gòu)的高分辨AFM圖a-c) 分別以worms , space fill和 ball and stick方式表示的survivin蛋白二聚體的三維結(jié)構(gòu)圖（PDB ID: MMDB_1XOX）， d) Survivin蛋白的AFM圖, e) 放大的survivin蛋白的AFM圖(d圖紅色框選定區(qū)域), f) Survivin蛋白的高分辨AFM圖(e圖中紅色框選定survivin蛋白)，內(nèi)圖為以wire方式表示的survivin抗體的三維結(jié)構(gòu)圖(來(lái)源于MMDB_1XOX)， g)大范圍survivin蛋白分布的AFM圖, h) Survivin蛋白的粒子分布柱狀圖, i) 粒子長(zhǎng)，寬與粒子等面積圓直徑的相互關(guān)系圖。

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文31圖1.2. 溶液中的survivin抗體與BSA結(jié)構(gòu)的高分辨AFM圖a)以 worms 方式表示的 survivin 抗體的 X 射線晶體學(xué)數(shù)據(jù)三維結(jié)構(gòu)圖(來(lái)源于 MMDB_1IGT)，b)以 worms 方式表示的 BSA 的 X 射線晶體學(xué)數(shù)據(jù)三維結(jié)構(gòu)圖 (來(lái)源于 MMDB_4ORO)， c)溶液中分布的 survivin 抗體與 BSA 的大范圍掃描的 AFM 圖, d) 選定的 survivin 抗體的高分辨 AFM 圖(c 圖中紅色框選定區(qū)域)，內(nèi)圖為以 wire 方式表示的 survivin 抗體的三維結(jié)構(gòu)圖(來(lái)源于 MMDB_3CM9), e) BSA 的高分辨 AFM 圖(c 圖中綠色框選定區(qū)域)，內(nèi)圖為以 ball andstick 方式表示的 BSA 晶體的三維結(jié)構(gòu)圖(來(lái)源于 MMDB_4ORO), f) Survivin 抗體 IgG 的三維立體圖。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2741054