發(fā)布時(shí)間：2020-07-03 10:09

【摘要】：研究背景與目的腦膠質(zhì)瘤是成人最常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤,目前各種治療療效均不理想。尋找和研究調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的相關(guān)基因?qū)⒂兄谶M(jìn)一步揭示膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)理,為其基因治療提供理想可靠的治療靶標(biāo)。microRNAs是一類(lèi)長(zhǎng)度為19-25個(gè)核苷酸內(nèi)源性非編碼的小分子單鏈RNA,研究表明,miR-130a可作為膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。但其在膠質(zhì)瘤中的體內(nèi)功能及其作用機(jī)制尚未明確。高遷移率族蛋白-2屬于HMG蛋白家族,其通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和化療耐藥導(dǎo)致膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后差。本研究通過(guò)檢測(cè)miR-130a在膠質(zhì)瘤中的表達(dá),并采用慢病毒構(gòu)建miR-130a穩(wěn)定過(guò)表達(dá)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株,檢測(cè)細(xì)胞增殖、侵襲能力的變化以及EMT表型的改變,進(jìn)一步探討miR-130a介導(dǎo)的分子機(jī)制,同時(shí)研究EZH2抑制miR-130a轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制,為發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤治療新靶點(diǎn)提供依據(jù)。研究?jī)?nèi)容與方法1.膠質(zhì)瘤中miR-130a基因表達(dá)特性的鑒定利用qRT-PCR檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株及不同級(jí)別腫瘤組織中miR-130a的表達(dá)水平。2.miR-130a在膠質(zhì)瘤中的功能初步研究用慢病毒構(gòu)建miR-130a穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株將膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中的miR-130a過(guò)表達(dá),同時(shí)以si-Scrambled片段作為陰性對(duì)照。利用RT-PCR檢測(cè)miR-130a過(guò)表達(dá)的效率。用噻唑藍(lán)比色(MTT)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-130a對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖功能的影響;運(yùn)用平板克隆實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-130a抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆形成的能力;運(yùn)用Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-130a可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲;采用裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-130a抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。3.miR-130a介導(dǎo)的分子機(jī)制初步研究miR-130a過(guò)表達(dá)后抑制了細(xì)胞的侵襲能力,故通過(guò)免疫熒光定性檢測(cè)細(xì)胞侵襲相關(guān)的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、微絲蛋白的表達(dá);通過(guò)Western blot定量檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白的表達(dá)。由于過(guò)表達(dá)miR-130a后,細(xì)胞出現(xiàn)G1期向S期轉(zhuǎn)化障礙并抑制細(xì)胞增殖,利用Western blot定量檢測(cè)與細(xì)胞周期G1/S期相關(guān)的CDK4、c-myc、CyclinD1蛋白的表達(dá)。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)HMGB2可能為miR-130a的直接靶基因,采用熒光定量PCR和Western blot驗(yàn)證過(guò)表達(dá)miR-130a可以抑制HMGB2的表達(dá);雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-130a可以靶向結(jié)合HMGB2 mRNA的3'UTR區(qū)域進(jìn)而抑制HMGB2基因的表達(dá);MTT實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-130a通過(guò)靶向HMGB2抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖;Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-130a通過(guò)靶向HMGB2來(lái)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲。4.EZH2抑制miR-130a轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制研究利用結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性?xún)?nèi)切酶法檢測(cè)細(xì)胞DNA甲基化水平;信息學(xué)分析EZH2可以結(jié)合miR-130a的啟動(dòng)子區(qū)域序列;染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證EZH2與miR-130a啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合;用RNA干擾技術(shù)將膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中EZH2沉默表達(dá),利用RT-PCR檢測(cè)U87中miR-130a表達(dá)水平;進(jìn)一步采用阿糖胞苷處理U87后檢測(cè)miR-130a的表達(dá)水平。結(jié)果在膠質(zhì)瘤中miR-130a的表達(dá)下調(diào)且過(guò)表達(dá)miR-130a能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力。動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證了 miR-130a抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。生物信息學(xué)分析提示HMGB2 mRNA的3'UTR含有miR-130a直接作用的靶序列,雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)一步驗(yàn)證該靶序列能與miR-130a結(jié)合,組織及細(xì)胞水平進(jìn)一步驗(yàn)證miR-130a對(duì)HMGB2蛋白表達(dá)的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平;過(guò)表達(dá)HMGB2能逆轉(zhuǎn)miR-130a對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制。EZH2通過(guò)組蛋白H3第27位賴(lài)氨酸上三甲基化(H3K27me3)來(lái)抑制miR-130a的表達(dá)。結(jié)論:miR-130a在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)降低;HMGB2介導(dǎo)了 miR-130a對(duì)膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為的抑制,miR-130a的表達(dá)受EZH2調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R739.41
【圖文】：

熒光定量ＰＣＲ檢測(cè)６２例膠質(zhì)瘤腫瘤組織和１５例正常腦組織中ｍｉＲ－１３０ａ逡逑的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與正常腦組織相比，膠質(zhì)瘤組織組中ｍｉＲ－１３０ａ的表達(dá)水逡逑平低于正常腦組織（圖１－２）。（縱坐標(biāo)值代表２＿Ａａ值）逡逑＜0逡逑吾邐８－逡逑全邐？逡逑Ｅ邐Ｋ逡逑１－邐＋逡逑ｇ邋Ｓ逡逑１－Ｓ邋４－逡逑ｇ－ｉ邐N逡逑Ｉ邐0ｌ邐，邐十Ｘ逡逑Ｓ．邐ＮＢＣ邋Ｇｒａｄｅ邋Ｇｒａｄｅ邋Ｇｒａｄｅ逡逑ＩＩ邐ＩＩＩ邐ＩＶ逡逑圖１－２膠質(zhì)瘤腫瘤組織中ｍｉＲ－１３０ａ的表達(dá)水平。逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｑＲＴ－ＰＣＲ邋ａｓｓａｙ邋ｒｅｖｅａｌｅｄ邋ｔｈａｔ邋ｍｉＲ－１３０ａ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｗａｓ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ逡逑ｄｅｃｒｅａｓｅｄ邋ｉｎ邋ｇｌｉｏｍａ邋ｔｉｓｓｕｅｓ（ｎ＝６２）邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｂｒａｉｎ邋ｔｉｓｓｕｅｓ（ｎ＝１５）．逡逑四、結(jié)論逡逑本節(jié)的研究發(fā)現(xiàn)ｍｉＲ－１３０ａ在膠質(zhì)瘤腫瘤組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，逡逑ｍｉＲ－１３０ａ的表達(dá)與腫瘤的病理級(jí)別呈相關(guān)性。逡逑２４逡逑

胞數(shù)鋪到９６孔板中，然后分別在轉(zhuǎn)染后１邋ｄａｙ、２邋ｄａｙｓ、３邋ｄａｙｓ、４邋ｄａｙｓ、５邋ｄａｙｓ、６邋ｄａｙｓ逡逑加入ＭＴＴ溶液，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在４５０ｎｍ處的ＯＤ值，結(jié)果顯示Ｕ８７中ｍｉＲ－１３０ａ逡逑過(guò)表達(dá)組在不同時(shí)間點(diǎn)的ＯＤ值均比對(duì)照組降低（圖２－２），這表明ｍｉＲ－邋１３０ａ對(duì)膠質(zhì)逡逑瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用。逡逑0邋－Ｉ邋ＬＶ－ｃｔｒｌ邐ＬＶ－ｍｉＲ－１３０ａ逡逑0邋－邐Ｊｇ，逡逑ＩＩ－逡逑Ｏ邋0逡逑ＣＴ３邋ｏ邋－邐＾逡逑0邋Ｉ邐，邐，邐，邐｜邐｜邐＾逡逑１邐２邐３邐４邐５邐６邐７逡逑Ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｔｉｍｅ（ｄａｙ）逡逑４３逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 謝強(qiáng);黃作平;閆雍容;李鋒;鐘雪云;;miR-221調(diào)控PTEN/Akt信號(hào)介導(dǎo)人膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的表達(dá)[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2014年02期

2 崔秀英;郭運(yùn)杰;姚和瑞;;耐藥乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/ADR中microRNA的分析[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2008年10期

本文編號(hào)：2739524