【摘要】：目的:設計并構建集磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)和聲動力治療(sonodynamic therapy,SDT)功能為一體的白蛋白納米聲敏劑HSA-Ce6-Mn,并研究其MRI引導下的腦膠質(zhì)瘤SDT作用。方法:(1)以人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)包裹二氫卟吩e6(Chlorin e6,Ce6)合成HSA-Ce6,并以HSA-Ce6作為螯合劑螯合具有MRI成像功能的Mn~(2+),合成具有成像功能的SDT納米聲敏劑HSA-Ce6-Mn。利用透射電子顯微鏡及動態(tài)光散射粒徑儀研究其形貌及粒徑,并利用紫外分光光度計和熒光波譜儀分析HSA-Ce6-Mn的紫外吸收光譜和熒光光譜。為了探索使用HSA-Ce6-Mn作為T1加權MRI造影劑的可能性,在室溫下用3.0T臨床MRI掃描儀掃描具有不同Mn ~(2+)濃度的HSA-Ce6-Mn溶液,以計算其最終T1弛豫率(r1)值。2'7'-二氯熒光素二乙酸酯(2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)是一種高靈敏度的活性氧(reactive oxygen species,ROS)分子探針,用于測量超聲輻照過程中HSA-Ce6-Mn介導產(chǎn)生的ROS水平。(2)采用熒光檢測方法評價細胞內(nèi)HSA-Ce6-Mn和Ce6的攝取量,以及聯(lián)合超聲處理后細胞內(nèi)ROS水平的變化。然后,通過標準MTT和鈣黃綠素-AM/碘化丙錠雙重染色測定各組(HSA-Ce6-Mn+US組、HSA-Ce6-Mn組、Ce6+US組、Ce6組、US組和Control組)的細胞活性。(3)建立BALB/C無胸腺裸鼠膠質(zhì)瘤模型,在不同時間點采集熒光圖像和MRI圖像。通過電感耦合等離子光譜發(fā)生儀確定血液的半衰期和24h組織分布。(4)將載有U87荷瘤小鼠隨機分為4組研究合成HSA-Ce6-Mn聯(lián)合高強度聚焦超聲(high-intensity focused ultrasound,HIFU)治療腦膠質(zhì)瘤的療效(HSA-Ce6-Mn+HIFU組、HSA-Ce6-Mn組、HIFU組和Saline組),繪制腫瘤生長曲線,評價體內(nèi)抑瘤效果,標準頸椎脫臼法處死小鼠,收集腫瘤和主要器官,然后用HE染色,檢測HSA-Ce6-Mn的生物安全性。(4)使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,所有數(shù)值均用(Mean±SD)表示,采用單因素方差分析,用于多組間兩兩比較,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果:(1)動態(tài)光散射測量表明,HSA-Ce6-Mn的平均流體力學直徑為100±2.4nm,同時透射電子顯微鏡圖像顯示HSA-Ce6-Mn的平均直徑為76±3.2nm,呈球形形態(tài)和均勻分布;HSA-Ce6-Mn和Ce6的熒光光譜沒有差別,HSA-Ce6-Mn的紫外可見光譜與Ce6相似,但HSA-Ce6-Mn在660nm處波峰0.30(×10~5 a.u.)較相同濃度Ce6在660nm處波峰2.54(×10~5 a.u.)顯著下降(P0.01);HSA-Ce6-Mn的r1值為12.2mM~(-1)S~(-1);熒光測定結果顯示,隨著照射時間和超聲強度的增加,ROS水平增加,說明HSA-Ce6-Mn介導ROS的產(chǎn)量依賴于超聲照射。(2)在細胞水平,熒光結果顯示,與Ce6(1.00±0.16)相比,HSA-Ce6-Mn細胞內(nèi)的歸一化熒光強度(2.97±0.34)顯著增強,二者有統(tǒng)計學差異(P0.01);HSA-Ce6-Mn+US組(2.84±0.07)的ROS水平顯著高于Ce6+US組(1.00±0.20)(P0.01);當藥物濃度達到20μg/L時,HSA-Ce6-Mn+US組(46.12±2.20)%的細胞活力顯著低于Ce6+US組(65.01±3.05)%(P0.01),單一的聲敏劑或超聲處理只能在誘導部分細胞死亡,與之形成鮮明對比的是,HSA-Ce6-Mn+US組在破壞癌細胞方面非常有效并且表現(xiàn)出濃度依賴性;鈣黃綠素-AM和碘化丙啶雙重染色結果直觀地表明HSA-Ce6-Mn+US組細胞死亡比例明顯高于Ce6+US組(藥物濃度20μg/L)。(3)在動物水平,實驗結果顯示,活體熒光成像顯示游離的Ce6在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中顯示出相對較弱的熒光,注射后24小時,全身幾乎沒有熒光信號,相反,在尾靜脈注射HSA-Ce6-Mn后,膠質(zhì)瘤部位的熒光信號可在注射后3h與周圍正常組織區(qū)域的熒光信號區(qū)分開來,24h瘤區(qū)熒光信號達高峰;MRI成像結果示,隨著時間間隔的增加,小鼠的腫瘤T1信號增強;血液中的半衰期為0.98h,24h腫瘤組織內(nèi)藥物分布量較高;(4)對比于Saline組,HSA-Ce6-Mn組處理后的腫瘤,其生長不受抑制,HIFU治療組中的腫瘤生長僅一定程度受到抑制,HSA-Ce6-Mn+HIFU治療組可以極大地抑制治療后腫瘤的生長。HSA-Ce6-Mn+HIFU組與其它組腫瘤體積差異顯著(P0.01);此外,各治療組均未見明顯的體重減輕和明顯的異常;生存曲線示HSA-Ce6-Mn+HIFU組小鼠較其它各組生存期延長,具有明顯差異(P0.01);HE結果示,在Saline組及HSA-Ce6-Mn組癌細胞仍保持其正常形態(tài),具有明顯的膜和核結構。HIFU組顯示出一段固縮細胞或細胞溶解,表明部分癌細胞被超聲波破壞。HSA-Ce6-Mn+HIFU組大量癌細胞凋亡。各治療組對裸鼠的組織臟器沒有炎癥及損傷。結論:本論文設計并構建了一種基于Ce6的納米聲敏劑,其結構簡單、生物安全好,通過螯合Mn~(2+),可實現(xiàn)納米體系內(nèi)聲敏劑與成像功能的有效整合,體內(nèi)的腫瘤靶向遞送,以及成像引導的SDT療法的協(xié)同作用,為臨床腫瘤聯(lián)合治療提供了一種新的思路與策略。
【學位授予單位】：三峽大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4
【圖文】：

三 峽 大 學 碩 士 學 位 論 文1.3 實驗方法1.3.1 材料合成及表征1.3.1.1HSA-Ce6-Mn 納米聲敏劑的合成將 80g 人血清白蛋白、50mM 谷胱甘肽溶解在 2mL 去離子水中，37℃反應 1h。加入 8mLCe6-乙醇溶液（已調(diào)整 Ce6 濃度為 2mg/mL），37℃攪拌 10min。之后，用12~14KDa 超濾管 4℃下去離子水中對懸浮液透析 12h 后，再與 MnCl2以 2：1 摩爾比混合 2h， 100KDa 超濾膜濾去過量的 Mncl2。HSA-Ce6-Mn 合成示意圖見圖 1 示。

三 峽 大 學 碩 士 學 位 論 文3) 再次孵育 4h 后，每孔加入 20μLMTS 溶液，繼續(xù)孵育 1h，酶標儀測。為檢測納米藥物 SDT 治療效應，實驗包括 6 個分組：對照組（Control組（US 組）、二氫卟吩 e6 組（Ce6 組）、二氫卟吩 e6+超聲組（Ce6+US聲敏劑組（HSA-Ce6-Mn 組）和納米聲敏劑+超聲組（HSA-Ce6-Mn+US 組胞存活率 = （各組 OD 值/Control 組 OD 值）× 100% 。

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本文編號：2737450