發(fā)布時(shí)間：2017-03-28 18:21

  本文關(guān)鍵詞：帕金森相關(guān)蛋白α-synuclein降解和parkin保護(hù)作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分帕金森相關(guān)蛋白α-synuclein新的降解機(jī)制的探討目的:α-突觸核蛋白(α-synuclein)是帕金森病(PD)一種重要的致病蛋白,其異常聚集的出現(xiàn)是帕金森病的主要病理特征。因此,及時(shí)有效地清除α-synucelin可能是治療帕金森病的一個(gè)潛在方法。本研究目的在于觀察線粒體自噬對(duì)α-synucelin蛋白降解的作用。方法:體外培養(yǎng)SH-SY5Y和He La細(xì)胞系,在細(xì)胞中建立EGFP-α-synuclein和其突變體EGFP-α-synuclein-A53T過表達(dá)模型。采用線粒體分離提取法檢測(cè)α-synuclein和α-synuclein-A53T在線粒體上的富集情況。加入線粒體解偶聯(lián)劑carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone(CCCP)、自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin)、自噬溶酶體抑制劑Bafilomycin A1等藥物處理細(xì)胞,運(yùn)用熒光顯微鏡觀察α-synuclein和α-synuclein-A53T熒光表達(dá)的強(qiáng)弱,western blot檢測(cè)α-synuclein、α-synuclein-A53T、TOMM20、COXIV等蛋白量的改變。此外在He La細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染Flag和EGFP-α-synuclein或EGFP-α-synuclein-A53T;Flag-Parkin和EGFP-α-synuclein或EGFP-α-synuclein-A53T,加入CCCP處理,用熒光顯微鏡檢測(cè)α-synuclein和α-synuclein-A53T熒光表達(dá)的強(qiáng)弱和western blot檢測(cè)α-synuclein和α-synuclein-A53T蛋白水平的變化。利用α-synuclein-A53T轉(zhuǎn)基因鼠模型,喂食含有CCCP處理過的食物,8個(gè)月后通過western blot檢測(cè)中腦組織α-synuclein的蛋白水平的改變。結(jié)果:線粒體分離實(shí)驗(yàn)表明α-synuclein和α-synuclein-A53T在線粒體上有富集。SH-SY5Y細(xì)胞過表達(dá)α-synuclein和α-synuclein-A53T后,加入CCCP誘導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生,發(fā)現(xiàn)α-synuclein和α-synuclein-A53T的熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比明顯減弱,western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)α-synuclein和α-synuclein-A53T的蛋白水平也明顯降低。而加入rapamycin(一種自噬誘導(dǎo)劑)并沒有引起α-synuclein和α-synuclein-A53T熒光強(qiáng)度和蛋白量的改變。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),CCCP+Bafilomycin A1處理時(shí),CCCP引起的α-synuclein-A53T蛋白量的減少能夠被Bafilomycin A1有效抑制。在Parkin缺陷的Hela細(xì)胞系中,加入CCCP和rapamycin處理后,不引起α-synuclein和α-synuclein-A53T量的變化。然而,在Hela細(xì)胞中過表達(dá)Parkin后,CCCP可引起α-synuclein和α-synuclein-A53T蛋白量的降低。熒光觀察結(jié)果也顯示α-synuclein和α-synuclein-A53T的熒光強(qiáng)度與對(duì)照組比明顯減弱。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CCCP藥物喂食的α-synuclein-A53T轉(zhuǎn)基因鼠與對(duì)照組相比,其α-synuclein在中腦表達(dá)量有明顯降低。結(jié)論α-synuclein和α-synuclein-A53T可通過線粒體自噬降解。這可能成為α-synuclein一條新的降解通路。第二部Parkin通過調(diào)控p62抑制6-OHDA引起的細(xì)胞死亡目的:Parkin蛋白編碼基因(PARK2)突變或缺失引起的Parkin蛋白功能障礙與帕金森病發(fā)生直接相關(guān)。本研究探討Parkin對(duì)神經(jīng)元保護(hù)效應(yīng)的分子機(jī)制。方法:采用免疫共沉淀法分析Parkin與p62的結(jié)合與泛素化情況。碘化丙啶(PI)和Hoechst雙染色法檢測(cè)細(xì)胞死亡情況。在過表達(dá)p62或者過表達(dá)Parkin的SH-SY5Y細(xì)胞系中加入6-OHDA處理,用western blot檢測(cè)ERK1/2的活化情況。He La細(xì)胞中過表達(dá)Parkin或者沉默p62后再過表達(dá)Parkin,用western blot檢測(cè)磷酸化ERK1/2和p62的蛋白水平的變化。結(jié)果:免疫沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)p62和Parkin有相互作用,并且Parkin能夠通過其E3泛素連接酶活性泛素化p62。Western blot結(jié)果顯示,過表達(dá)Parkin能夠增加p62的蛋白量,同時(shí)抑制ERK1/2的活化。但是當(dāng)沉默掉p62后,Parkin不能再抑制ERK1/2的活化,提示Parkin對(duì)ERK1/2的作用依賴于p62。在6-OHDA處理細(xì)胞中,Parkin和p62都能降低6-OHDA引起的磷酸化ERK1/2水平的提高。PI染色結(jié)果顯示過表達(dá)Parkin能夠抑制6-OHDA引起的多巴胺能(DA)神經(jīng)元的死亡。結(jié)論:Parkin通過泛素化穩(wěn)定p62的蛋白量來降低6-OHDA引起的ERK1/2活化,從而起到對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：α-synuclein 降解 線粒體自噬 CCCP Parkin ERK1/2活化 p62 6-OHDA SH-SY5Y cells
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R742.5
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-12
• 第一部分 帕金森相關(guān)蛋白 α-synuclein新的降解機(jī)制的探討12-33
• 材料與方法12-20
• 結(jié)果20-26
• 討論26-29
• 參考文獻(xiàn)29-33
• 第二部分Parkin通過調(diào)控p62抑制 6-OHDA引起的細(xì)胞死亡33-48
• 材料與方法34-38
• 結(jié)果38-43
• 討論43-45
• 參考文獻(xiàn)45-48
• 綜述：α-突觸核蛋白降解的研究進(jìn)展48-57
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 英文縮寫詞表57-58
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文58-59
• 致謝59-60

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本文編號(hào)：272796