本文關(guān)鍵詞：VEGF-A 165對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP-25質(zhì)粒的NSC34細(xì)胞的ALS細(xì)胞模型的影響及作用機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的退行性病變,主要表現(xiàn)為肌無(wú)力、肌萎縮、癱瘓。發(fā)病年齡一般在35-50歲之間,生存期3-5年,迄今尚無(wú)有效的治療方法,目前利魯唑是市場(chǎng)上唯一被美國(guó)FDA批準(zhǔn)對(duì)ALS治療有效的藥物,但只能平均延長(zhǎng)患者生存期2-3月。大約90-95%為散發(fā)型,5-10%為家族型。在家族型ALS中,突變的超氧化物歧化酶-1(SOD-1)基因是發(fā)病的主要原因。另外,編碼突變蛋白TDP-43的TARDBP基因以及編碼突變型RNA結(jié)合蛋白的FUS基因,都是與家族型ALS發(fā)病相關(guān)的基因。TDP43是由TARDBP基因中的6個(gè)外顯子編碼,TDP-43蛋白由414個(gè)氨基酸組成,由2個(gè)RNA識(shí)別序列和1個(gè)富含甘氨酸的C末端組成,具有DNA以及RNA結(jié)合蛋白的能力。同時(shí),TDP-43可在富含甘氨酸的末端被截?cái)?形成兩個(gè)C末端的片段,分別為25KD、35KD,TDP25、TDP35都具有細(xì)胞毒性,其中TDP25的細(xì)胞毒性是其中最強(qiáng)的。雖然ALS的發(fā)病機(jī)制并不十分明確,但是研究表明與線(xiàn)粒體的損傷、谷氨酸興奮性毒性、免疫系統(tǒng)的破壞、異常蛋白聚集等有關(guān)。此外,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)不足也是重要原因。各種生長(zhǎng)因子包括VEGF、IGF-1等在A(yíng)LS中的表達(dá)是不同的,但它們都有巨大的神經(jīng)保護(hù)作用,促進(jìn)ALS中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的增殖。VEGF是血管源性的生長(zhǎng)因子,它對(duì)各種細(xì)胞都有高效的促進(jìn)分裂能力以及保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞避免腦損害的能力,對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和調(diào)控有著重要的作用,而且對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)、神經(jīng)元的遷移有著直接的作用。最近的研究表明,當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞處于低氧、低糖、氧化應(yīng)激等不利條件時(shí),VEGF可作為調(diào)節(jié)者調(diào)控各種復(fù)雜的機(jī)制,避免神經(jīng)元死亡和刺激神經(jīng)生長(zhǎng)。VEGF家族可分為7種亞型,包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PLGF、VEGF-E、sv VEGF。VEGF-A是由33-42k Da組成的二聚體糖蛋白。它的基因的表達(dá)受許多條件的影響,包括低氧、生長(zhǎng)因子、NO、p53突變、甲狀腺生長(zhǎng)激素、腫瘤生長(zhǎng)因子。VEGF-A的高表達(dá)信使RNA主要存在于腎上腺、肝臟、心臟、腦。VEGF-A由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成,根據(jù)其活性的不同又分為多種亞型,其中VEGF165是活性最強(qiáng)的。研究表明,在過(guò)表達(dá)VEGF-A的SOD-1 G93A轉(zhuǎn)基因ALS小鼠與單純的SOD-1 G93A轉(zhuǎn)基因ALS小鼠相比,其神經(jīng)元的死亡減少、疾病的發(fā)病時(shí)間延遲、生存率增加。目前尚無(wú)VEGF-A 165在穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP25的NSC34細(xì)胞的ALS細(xì)胞模型中治療效果的研究報(bào)道。目的:研究VEGF-A 165對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP25的NSC34細(xì)胞的ALS細(xì)胞模型的保護(hù)作用,并進(jìn)一步探討VEGF-A 165發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制。方法:首先采用流式細(xì)胞儀篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP25的NSC34細(xì)胞,將穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP-25質(zhì)粒的NSC34細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng),提取蛋白質(zhì),進(jìn)而通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞中TDP25蛋白的表達(dá)水平,證明選用的細(xì)胞是穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP25的NSC34細(xì)胞以建立ALS的細(xì)胞模型。然后用不同濃度的VEGF-A 165處理穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP25的NSC34細(xì)胞,采用CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力,確定VEGF-A 165對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP25的NSC34細(xì)胞的最適藥物濃度。用最適藥物濃度的VEGF-A 165干預(yù)細(xì)胞,測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)含量觀(guān)察VEGF-A 165對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP25的NSC34細(xì)胞的保護(hù)作用。最后,采用免疫印跡法檢測(cè)在凋亡通路上caspase3蛋白水平的變化,及在氧化應(yīng)激通路上HO-1蛋白水平的變化,以研究VEGF-A 165的作用通路。結(jié)果:1通過(guò)western blot法檢測(cè)流式細(xì)胞儀篩選后細(xì)胞中TDP25蛋白,結(jié)果顯示細(xì)胞中有TDP25蛋白的表達(dá),表明選用的細(xì)胞是穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP25的NSC34細(xì)胞,成功建立ALS的細(xì)胞模型。2觀(guān)察不同濃度的VEGF-A 165處理穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP25的NSC34細(xì)胞后細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及細(xì)胞形態(tài),CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力,結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)VEGF-A 165濃度達(dá)到5ng/ml時(shí),細(xì)胞數(shù)目多,細(xì)胞突起展開(kāi),細(xì)胞形態(tài)最好,細(xì)胞活力最高,因此篩選出VEGF-A 165的最適藥物濃度為5ng/ml。3用最適藥物濃度的VEGF-A 165干預(yù)細(xì)胞,LDH、MDA的檢測(cè)結(jié)果顯示,給藥組與對(duì)照組比較給藥組LDH水平、MDA水平均明顯下降(P0.05)。4 western blot法檢測(cè)caspase3、HO-1蛋白水平的變化,結(jié)果顯示給藥組與對(duì)照組比較,caspase3和HO-1蛋白水平均顯著降低(P0.01)。結(jié)論:VEGF-A 165對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP25的NSC34細(xì)胞有保護(hù)作用,其發(fā)揮保護(hù)作用是通過(guò)抑制caspase3、HO-1水平實(shí)現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：VEGF 肌萎縮側(cè)索硬化 NSC34細(xì)胞 TDP43 凋亡
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R741
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文縮寫(xiě)10-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-24
• 結(jié)果24-25
• 附圖25-30
• 討論30-32
• 結(jié)論32
• 參考文獻(xiàn)32-36
• 綜述 凋亡在神經(jīng)變性病中的作用36-46
• 參考文獻(xiàn)41-46
• 致謝46-47
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷47

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