【摘要】：研究目的癲癇是臨床上常見的一種慢性反復(fù)發(fā)作的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。其特征主要表現(xiàn)為癲癇發(fā)作時(shí)腦內(nèi)神經(jīng)元異常同步化放電。癲癇反復(fù)發(fā)作會(huì)引起神經(jīng)元損傷,導(dǎo)致多種腦功能障礙產(chǎn)生。目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為,這種腦內(nèi)神經(jīng)元異常同步化放電的出現(xiàn)是由于興奮與抑制失平衡所致。多種抗癲癇藥物,通過增強(qiáng)腦內(nèi)GABA受體介導(dǎo)的抑制作用,調(diào)節(jié)興奮與抑制平衡,以達(dá)到抑制癲癇發(fā)作及減少腦損傷的目的。然而由于技術(shù)手段所限,增強(qiáng)GABA受體功能,抑制癲癇發(fā)作及腦功能損傷的作用機(jī)制還無法在活體動(dòng)物細(xì)胞、亞細(xì)胞及受體水平進(jìn)行研究。本課題應(yīng)用雙光子鈣成像、光解籠鎖、活體動(dòng)物靶向及陰影膜片鉗以及活體動(dòng)物受體熒光標(biāo)記等先進(jìn)技術(shù)手段,觀察快速GABA干預(yù),抑制活體動(dòng)物皮層單神經(jīng)元癇樣放電及胞體癇樣鈣信號(hào)、樹突樹突棘癇樣鈣信號(hào)以及延緩AMPA受體損傷等作用,在細(xì)胞、亞細(xì)胞以及受體水平,對(duì)增強(qiáng)GABA受體功能,抑制癲癇發(fā)作的機(jī)制進(jìn)行研究。研究方法一、活體動(dòng)物細(xì)胞水平快速GABA干預(yù)抑制癇樣放電。(1)雙光子陰影膜片鉗電流刺激方法誘發(fā)活體小鼠皮層神經(jīng)元高頻動(dòng)作電位發(fā)放。(2)雙光子激光解籠鎖(uncage)光敏感藥物Rubi-GABA釋放GABA。(3)鈣熒光指示劑標(biāo)記活體小鼠皮層神經(jīng)元。(4)雙光子顯微鏡觀察活體小鼠皮層神經(jīng)元胞體鈣信號(hào)。(5)雙光子顯微鏡引導(dǎo)細(xì)胞外貼付方法記錄活體小鼠皮層神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放。二、活體動(dòng)物亞細(xì)胞水平快速GABA干預(yù)抑制癇樣鈣信號(hào)。(1)雙光子陰影膜片鉗方法記錄活體非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物絨猴皮層神經(jīng)元膜電位。(2)雙光子鈣成像技術(shù)觀察絨猴及小鼠皮層神經(jīng)元樹突樹突棘鈣信號(hào)。(3)病毒轉(zhuǎn)染方法在活體小鼠皮層神經(jīng)元標(biāo)記基因編碼鈣敏感蛋白。三、快速GABA干預(yù)延緩癲癇發(fā)作所致AMPA受體損傷。(1)子宮胚胎電穿孔技術(shù)(IUE)轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記AMPA受體以及神經(jīng)元結(jié)構(gòu)標(biāo)記質(zhì)粒。(2)雙光子靶向及陰影膜片鉗方法分別記錄轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染AMPA受體皮層神經(jīng)元電生理指標(biāo)以及突觸傳遞功能。(3)雙光子顯微鏡觀察AMPA受體損傷變化。研究結(jié)果第一部分,雙光子陰影膜片鉗電流刺激誘發(fā)活體小鼠皮層單個(gè)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放。雙光子uncage技術(shù)實(shí)現(xiàn)活體小鼠皮層單細(xì)胞動(dòng)作電位精準(zhǔn)快速抑制。雙光子顯微鏡引導(dǎo)細(xì)胞貼付記錄方法,記錄到致癇藥物誘發(fā)的神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢活l率增加以及GABA干預(yù)后動(dòng)作電位被抑制。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用雙光子鈣成像技術(shù)觀察到致癇藥物誘發(fā)鈣信號(hào)頻率增加,幅值無明顯變化以及GABA干預(yù)后癇樣鈣信號(hào)被抑制。第二部分,實(shí)驗(yàn)應(yīng)用雙光子陰影膜片鉗記錄到活體非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物絨猴皮層神經(jīng)元膜電位變化。雙光子鈣成像方法記錄絨猴皮層神經(jīng)元樹突樹突棘鈣信號(hào)特點(diǎn),并證明局部鈣信號(hào)產(chǎn)生依賴于NMDA受體通道功能。雙光子顯微鏡觀察到致癇藥物誘發(fā)的樹突樹突棘癇樣鈣信號(hào)發(fā)放以及快速給予GABA干預(yù)后,樹突樹突棘癇樣鈣信號(hào)被抑制。第三部分,實(shí)驗(yàn)應(yīng)用雙光子靶向及陰影膜片鉗等方法證明子宮胚胎電穿孔方法轉(zhuǎn)染外源性AMPA受體沒有改變成年期動(dòng)物活體細(xì)胞的電生理特性及其突觸傳遞功能;應(yīng)用雙光子顯微鏡觀察到熒光標(biāo)記AMPA受體快速損傷變化及快速給予GABA干預(yù)延緩AMPA受體損傷。研究結(jié)論本論文應(yīng)用雙光子陰影膜片鉗及uncage技術(shù),成功實(shí)現(xiàn)活體小鼠皮層單細(xì)胞動(dòng)作電位精準(zhǔn)快速抑制。這一結(jié)果表明,雙光子uncage抑制方法具有受體特異性選擇干預(yù);空間分辨率高,能夠?qū)崿F(xiàn)單細(xì)胞抑制;時(shí)間分辨率高,起效以及失效均迅速等諸多優(yōu)點(diǎn),為大腦局灶性癲癇精準(zhǔn)快速及無副作用治療提供思路。通過應(yīng)用細(xì)胞貼付記錄、鈣熒光指示劑標(biāo)記及雙光子鈣成像等方法,觀察到GABA可以抑制活體動(dòng)物皮層神經(jīng)元癇樣放電及癇樣鈣信號(hào)。通過應(yīng)用基因編碼鈣敏感蛋白標(biāo)記及雙光子鈣成像等方法,觀察到快速GABA干預(yù)可以抑制活體動(dòng)物皮層神經(jīng)元樹突樹突棘癇樣鈣信號(hào)。結(jié)果表明,快速給予抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA,增強(qiáng)GABA受體介導(dǎo)的抑制作用,調(diào)節(jié)興奮與抑制平衡,可以在細(xì)胞以及亞細(xì)胞水平抑制動(dòng)物癇樣電信號(hào)及鈣信號(hào),這可做為抗癲癇藥物在活體動(dòng)物細(xì)胞及亞細(xì)胞水平作用機(jī)制的直接證據(jù)�；铙w動(dòng)物AMPA受體可視化技術(shù)使我們能夠在活體動(dòng)物水平觀察到致癇藥物誘發(fā)癲癇發(fā)作后AMPA受體的損傷變化以及GABA快速干預(yù)后損傷變化被延緩的現(xiàn)象。這一結(jié)果為癲癇發(fā)作的興奮與抑制失衡理論提供了受體水平的實(shí)驗(yàn)證明,為今后癲癇的治療方法探索以及抗癲癇藥物靶點(diǎn)選擇等研究提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型對(duì)于人類各種疾病發(fā)病機(jī)制及治療的研究具有重要意義。我們將陰影膜片鉗以及樹突樹突棘水平鈣成像技術(shù)推展到活體非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物上,為非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞以及亞細(xì)胞水平的研究提供技術(shù)支持,也為在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物層面探討癲癇發(fā)作機(jī)制進(jìn)行初步探索。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R742.1
【圖文】：

1.1.5.3 雙光子激光掃描顯微鏡成像本部分實(shí)驗(yàn)，采用的雙光子顯微鏡平臺(tái)是日本尼康公司商用 NikonA1R MP型雙光子顯微鏡系統(tǒng)，見圖 1.1 左側(cè)部分。其搭載一臺(tái) MaiTai DeepSee 雙光子紅外飛秒激光器（SpectralPhysics 公司，波長(zhǎng)范圍：690-1040nm，脈沖寬度 70fs，脈沖頻率 80MHz），并配備有高速共振式掃描器（resonantscanner），高分辨率檢流計(jì)式掃描器以及四通道 NDD 探測(cè)器（non-descanneddetectors）。顯微鏡成像軟件為 Nikon NIS-Element C。對(duì)神經(jīng)元胞體及其亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)樹突進(jìn)行成像時(shí)，采用 800nm 激光波長(zhǎng)，40×0.8NA（數(shù)值孔徑）水鏡，512×512 像素，30 幀每秒掃描速度，視場(chǎng)為 200μm 200μm。根據(jù)成像深度調(diào)節(jié)激光功率（30-80mW）。5-10分鐘成像時(shí)間窗內(nèi)，沒有出現(xiàn)明顯的光損傷以及光漂白現(xiàn)象。每個(gè)細(xì)胞記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，顯示出清晰的細(xì)胞胞體及樹突樹突棘形態(tài)結(jié)構(gòu)。應(yīng)用 Z 軸掃描系統(tǒng)，完成細(xì)胞三維成像。多細(xì)胞鈣信號(hào)記錄實(shí)驗(yàn)，根據(jù)成像需要每次記錄 30-60 秒。

圖 1.1 課題實(shí)驗(yàn)室美國 axon 200B 膜片鉗記錄系統(tǒng)（左側(cè)）以及日本尼康（Nikon）A1R MP 雙光子顯微鏡（右側(cè)）1.1.5.4 活體動(dòng)物雙光子陰影全細(xì)胞膜片鉗記錄（whole-cell recording）及細(xì)胞貼付記錄（cell-attach recording）。全細(xì)胞膜片鉗記錄（whole-cell recording）：（1）小鼠固定于雙光子記錄平臺(tái)下，記錄槽內(nèi)灌流人工腦脊液并通入混合氣體（95% O2 / 5% CO2）提供氧氣以及維持 PH 值。關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室照明燈并將其余所有可見光源用兩層紅色過濾紙遮蓋確保光敏感藥物 Rubi-GABA 不會(huì)光解。記錄電極內(nèi)沖入含有 Alexa594 熒光指示劑的電極內(nèi)液，給藥電極加入含有 Rubi-GABA（200μM）的細(xì)胞外液（loading solution）。記錄電極進(jìn)入腦脊液前給予 20-30 mmpa 的正壓，防止電極堵塞。給藥電極進(jìn)入過程中，均不給予正壓。微操系統(tǒng)操控兩側(cè)臂并相對(duì)放置。（2）明場(chǎng)光源下（光源前方紅色濾紙遮蓋），應(yīng)用 Nikon40×0.8NA 物鏡調(diào)

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本文編號(hào)：2722317