【摘要】：研究目的癲癇是臨床上常見的一種慢性反復發(fā)作的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。其特征主要表現(xiàn)為癲癇發(fā)作時腦內(nèi)神經(jīng)元異常同步化放電。癲癇反復發(fā)作會引起神經(jīng)元損傷,導致多種腦功能障礙產(chǎn)生。目前主流觀點認為,這種腦內(nèi)神經(jīng)元異常同步化放電的出現(xiàn)是由于興奮與抑制失平衡所致。多種抗癲癇藥物,通過增強腦內(nèi)GABA受體介導的抑制作用,調(diào)節(jié)興奮與抑制平衡,以達到抑制癲癇發(fā)作及減少腦損傷的目的。然而由于技術手段所限,增強GABA受體功能,抑制癲癇發(fā)作及腦功能損傷的作用機制還無法在活體動物細胞、亞細胞及受體水平進行研究。本課題應用雙光子鈣成像、光解籠鎖、活體動物靶向及陰影膜片鉗以及活體動物受體熒光標記等先進技術手段,觀察快速GABA干預,抑制活體動物皮層單神經(jīng)元癇樣放電及胞體癇樣鈣信號、樹突樹突棘癇樣鈣信號以及延緩AMPA受體損傷等作用,在細胞、亞細胞以及受體水平,對增強GABA受體功能,抑制癲癇發(fā)作的機制進行研究。研究方法一、活體動物細胞水平快速GABA干預抑制癇樣放電。(1)雙光子陰影膜片鉗電流刺激方法誘發(fā)活體小鼠皮層神經(jīng)元高頻動作電位發(fā)放。(2)雙光子激光解籠鎖(uncage)光敏感藥物Rubi-GABA釋放GABA。(3)鈣熒光指示劑標記活體小鼠皮層神經(jīng)元。(4)雙光子顯微鏡觀察活體小鼠皮層神經(jīng)元胞體鈣信號。(5)雙光子顯微鏡引導細胞外貼付方法記錄活體小鼠皮層神經(jīng)元動作電位發(fā)放。二、活體動物亞細胞水平快速GABA干預抑制癇樣鈣信號。(1)雙光子陰影膜片鉗方法記錄活體非人靈長類動物絨猴皮層神經(jīng)元膜電位。(2)雙光子鈣成像技術觀察絨猴及小鼠皮層神經(jīng)元樹突樹突棘鈣信號。(3)病毒轉(zhuǎn)染方法在活體小鼠皮層神經(jīng)元標記基因編碼鈣敏感蛋白。三、快速GABA干預延緩癲癇發(fā)作所致AMPA受體損傷。(1)子宮胚胎電穿孔技術(IUE)轉(zhuǎn)染熒光標記AMPA受體以及神經(jīng)元結(jié)構標記質(zhì)粒。(2)雙光子靶向及陰影膜片鉗方法分別記錄轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染AMPA受體皮層神經(jīng)元電生理指標以及突觸傳遞功能。(3)雙光子顯微鏡觀察AMPA受體損傷變化。研究結(jié)果第一部分,雙光子陰影膜片鉗電流刺激誘發(fā)活體小鼠皮層單個神經(jīng)元動作電位發(fā)放。雙光子uncage技術實現(xiàn)活體小鼠皮層單細胞動作電位精準快速抑制。雙光子顯微鏡引導細胞貼付記錄方法,記錄到致癇藥物誘發(fā)的神經(jīng)元動作電位頻率增加以及GABA干預后動作電位被抑制。實驗應用雙光子鈣成像技術觀察到致癇藥物誘發(fā)鈣信號頻率增加,幅值無明顯變化以及GABA干預后癇樣鈣信號被抑制。第二部分,實驗應用雙光子陰影膜片鉗記錄到活體非人靈長類動物絨猴皮層神經(jīng)元膜電位變化。雙光子鈣成像方法記錄絨猴皮層神經(jīng)元樹突樹突棘鈣信號特點,并證明局部鈣信號產(chǎn)生依賴于NMDA受體通道功能。雙光子顯微鏡觀察到致癇藥物誘發(fā)的樹突樹突棘癇樣鈣信號發(fā)放以及快速給予GABA干預后,樹突樹突棘癇樣鈣信號被抑制。第三部分,實驗應用雙光子靶向及陰影膜片鉗等方法證明子宮胚胎電穿孔方法轉(zhuǎn)染外源性AMPA受體沒有改變成年期動物活體細胞的電生理特性及其突觸傳遞功能;應用雙光子顯微鏡觀察到熒光標記AMPA受體快速損傷變化及快速給予GABA干預延緩AMPA受體損傷。研究結(jié)論本論文應用雙光子陰影膜片鉗及uncage技術,成功實現(xiàn)活體小鼠皮層單細胞動作電位精準快速抑制。這一結(jié)果表明,雙光子uncage抑制方法具有受體特異性選擇干預;空間分辨率高,能夠?qū)崿F(xiàn)單細胞抑制;時間分辨率高,起效以及失效均迅速等諸多優(yōu)點,為大腦局灶性癲癇精準快速及無副作用治療提供思路。通過應用細胞貼付記錄、鈣熒光指示劑標記及雙光子鈣成像等方法,觀察到GABA可以抑制活體動物皮層神經(jīng)元癇樣放電及癇樣鈣信號。通過應用基因編碼鈣敏感蛋白標記及雙光子鈣成像等方法,觀察到快速GABA干預可以抑制活體動物皮層神經(jīng)元樹突樹突棘癇樣鈣信號。結(jié)果表明,快速給予抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA,增強GABA受體介導的抑制作用,調(diào)節(jié)興奮與抑制平衡,可以在細胞以及亞細胞水平抑制動物癇樣電信號及鈣信號,這可做為抗癲癇藥物在活體動物細胞及亞細胞水平作用機制的直接證據(jù)�；铙w動物AMPA受體可視化技術使我們能夠在活體動物水平觀察到致癇藥物誘發(fā)癲癇發(fā)作后AMPA受體的損傷變化以及GABA快速干預后損傷變化被延緩的現(xiàn)象。這一結(jié)果為癲癇發(fā)作的興奮與抑制失衡理論提供了受體水平的實驗證明,為今后癲癇的治療方法探索以及抗癲癇藥物靶點選擇等研究提供重要的實驗依據(jù)。非人靈長類動物模型對于人類各種疾病發(fā)病機制及治療的研究具有重要意義。我們將陰影膜片鉗以及樹突樹突棘水平鈣成像技術推展到活體非人靈長類動物上,為非人靈長類動物細胞以及亞細胞水平的研究提供技術支持,也為在非人靈長類動物層面探討癲癇發(fā)作機制進行初步探索。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R742.1
【圖文】：

1.1.5.3 雙光子激光掃描顯微鏡成像本部分實驗，采用的雙光子顯微鏡平臺是日本尼康公司商用 NikonA1R MP型雙光子顯微鏡系統(tǒng)，見圖 1.1 左側(cè)部分。其搭載一臺 MaiTai DeepSee 雙光子紅外飛秒激光器（SpectralPhysics 公司，波長范圍：690-1040nm，脈沖寬度 70fs，脈沖頻率 80MHz），并配備有高速共振式掃描器（resonantscanner），高分辨率檢流計式掃描器以及四通道 NDD 探測器（non-descanneddetectors）。顯微鏡成像軟件為 Nikon NIS-Element C。對神經(jīng)元胞體及其亞細胞結(jié)構樹突進行成像時，采用 800nm 激光波長，40×0.8NA（數(shù)值孔徑）水鏡，512×512 像素，30 幀每秒掃描速度，視場為 200μm 200μm。根據(jù)成像深度調(diào)節(jié)激光功率（30-80mW）。5-10分鐘成像時間窗內(nèi)，沒有出現(xiàn)明顯的光損傷以及光漂白現(xiàn)象。每個細胞記錄實驗結(jié)束之后，顯示出清晰的細胞胞體及樹突樹突棘形態(tài)結(jié)構。應用 Z 軸掃描系統(tǒng)，完成細胞三維成像。多細胞鈣信號記錄實驗，根據(jù)成像需要每次記錄 30-60 秒。

圖 1.1 課題實驗室美國 axon 200B 膜片鉗記錄系統(tǒng)（左側(cè)）以及日本尼康（Nikon）A1R MP 雙光子顯微鏡（右側(cè)）1.1.5.4 活體動物雙光子陰影全細胞膜片鉗記錄（whole-cell recording）及細胞貼付記錄（cell-attach recording）。全細胞膜片鉗記錄（whole-cell recording）：（1）小鼠固定于雙光子記錄平臺下，記錄槽內(nèi)灌流人工腦脊液并通入混合氣體（95% O2 / 5% CO2）提供氧氣以及維持 PH 值。關閉實驗室照明燈并將其余所有可見光源用兩層紅色過濾紙遮蓋確保光敏感藥物 Rubi-GABA 不會光解。記錄電極內(nèi)沖入含有 Alexa594 熒光指示劑的電極內(nèi)液，給藥電極加入含有 Rubi-GABA（200μM）的細胞外液（loading solution）。記錄電極進入腦脊液前給予 20-30 mmpa 的正壓，防止電極堵塞。給藥電極進入過程中，均不給予正壓。微操系統(tǒng)操控兩側(cè)臂并相對放置。（2）明場光源下（光源前方紅色濾紙遮蓋），應用 Nikon40×0.8NA 物鏡調(diào)

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本文編號：2722317