【摘要】：研究背景與目的:膠質母細胞瘤是是膠質細胞產(chǎn)生的腫瘤集合,它是最常見和最致命的原發(fā)性腦腫瘤~([1]),也是最具攻擊性的膠質瘤類型。由于其復雜的表型,它也被稱為多形性膠質母細胞瘤(GBM)。多形性膠質母細胞瘤是惡性程度最高的膠質瘤(世界衛(wèi)生組織WHO IV級),盡管使用目前的標準治療,進行了積極的手術、放射治療和化療干預,患者的中位生存期也僅為診斷后15個月~([2])。近年來,白藜蘆醇,一種存在于虎杖、桑椹和葡萄等植物中的多酚類化合物,它具有諸如預防腫瘤和心腦血管疾病、抗炎和抗氧化等有益的生物學功效。業(yè)已發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇能有效抑制多種腫瘤細胞的體外生長,誘導其分化和凋亡,其中包括膠質母細胞瘤細胞系。但是不同的膠質母細胞瘤細胞系由于某些未知原因對其具有藥物敏感性差異。外泌體是一類由活細胞主動分泌到體外的,直徑在30nm-200nm的盤狀微囊泡,其中包含了多種復雜的RNA以及蛋白質等。它可介導細胞間的交流和遷移,與腫瘤細胞的生長也有密切的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細胞會分泌大量攜帶惡性轉化相關蛋白的外泌體,推測其與腫瘤細胞的藥物敏感性密切相關。鑒于以上相關資料的搜集與整理,本課題研究,認為外泌體可能是造成膠質母細胞瘤白藜蘆醇敏感性差異的可能原因。為此,本實驗目的為:1.驗證U251、LN428膠質瘤細胞對白藜蘆醇的藥物敏感性差異。2.探究腫瘤外泌體與U251、LN428共培養(yǎng)后,對白藜蘆醇藥物敏感性的改變。3.檢測白藜蘆醇處理前后U251、LN428膠質瘤細胞外泌體各蛋白的表達差異,探究導致膠質瘤細胞白藜蘆醇敏感性的差異的關鍵調控蛋白。4.通過蛋白調控因子的生物信息學分析探究其藥物敏感調控功能。材料與方法:本課題選用一對白藜蘆醇敏感和耐藥的人膠質母細胞瘤細胞系U251和LN428細胞作為研究對象,采用MTT法核實白藜蘆醇對兩者的敏感性差異;通過HE染色觀察藥物處理后細胞凋亡的形態(tài)學變化。同時,采用超速離心法提取白藜蘆醇用藥前后U251及LN428細胞上清液中外泌體,通過電鏡及Western-blotting對其加以鑒定。應用納米顆粒跟蹤分析技術對各組外泌體進行定量分析,測定細胞的外泌體分泌水平。為探究外泌體對細胞藥物敏感性的影響,將LN428細胞與U251/N或U251/Res外泌體共孵育48h后再用濃度為100μmol/L的白藜蘆醇處理48h;反之亦然,將U251細胞與LN428/N或LN428/Res外泌體共孵育48h后再用濃度為100μmol/L的白藜蘆醇處理48h,最后將各組進行MTT檢測其細胞活性。為了進一步探討不同人膠質母細胞瘤對白藜蘆醇的敏感性差異,先運用BCA法對外泌體總蛋白進行定量,然后通過液相色譜-串聯(lián)質譜法對外泌體各蛋白進行定性與定量,分析比對加藥前后各指標的變化,發(fā)現(xiàn)導致藥物敏感或耐受的因子,通過GO富集分析和KEGG生物信息學分析對其功能及分子機制進行預測,并總結其相互關聯(lián)及影響。結果:1.U251細胞系在白藜蘆醇處理48h后,細胞出現(xiàn)皺縮、脫落,其生長明顯受阻,細胞數(shù)量顯著減少(85.7%)。LN428細胞系在白藜蘆醇處理后,與對照組相比,細胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化,細胞數(shù)量未顯著減少。MTT顯示,白藜蘆醇處理48h的U251細胞的OD值(OD=0.310+0.020,細胞活性為50.1%),低于對照組(OD=0.618+0.103,p0.01);而LN428白藜蘆醇處理48h后(OD=0.743+0.047),細胞活性與對照組(OD=0.722+0.185,p=0.375)則無明顯差異。2.對外泌體進行的透射電鏡檢測顯示,提取液中含有大量30nm-200nm的橢圓形或圓形盤狀囊泡結構。對外泌體進行WB檢測發(fā)現(xiàn),兩個細胞系分泌的外泌體中均存在特異性表達蛋白CD63,而β肌動蛋白則未被檢測到,說明本實驗成功富集樣品中的外泌體且無明顯其余細胞蛋白的污染。3.對用藥前后膠質瘤細胞U251及LN428分泌外泌體進行的納米顆粒跟蹤分析發(fā)現(xiàn),所提取的外泌體直徑在30nm-200nm之間,呈散在分布或聚集成團。NTA外泌體定量分析提示,白藜蘆醇可使U251細胞的外泌體分泌增加4.2倍,而LN428細胞的外泌體分泌僅增加12.1%。4.外泌體與細胞共培養(yǎng)的MTT結果顯示,U251/N外泌體能提高LN428對白藜蘆醇的藥物敏感性(OD=0.624+0.027),而U251/Res外泌體(OD=0.703+0.047,p=0.043)與PBS對照組(OD=0.743+0.040,p=0.011)則不能。對于U251細胞,LN428/N外泌體(OD=0.295+0.020,p=0.145)和LN428/Res外泌體(OD=0.334+0.036,p=0.173)均不能改變U251對白藜蘆醇的敏感性。5.運用Label-free液相色譜-串聯(lián)質譜法發(fā)現(xiàn),U251細胞外泌體有123種不同的蛋白質,而LN428細胞外泌體則達216種。U251/N外泌體具有更高的角蛋白(KRT包括KRT18,KRT19),H2A組蛋白家族成員X水平(H2AX包括H2AFX,HIST1H2AD),較低的Ras相關蛋白1(Rap1包括Rap1B,Rap1A),聚合物絲形成肌動蛋白水平(F-actin包括ACTB,ACTA2)和鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(G蛋白包括GNAS,GNAI)。相反,LN428/N外泌體的蛋白質組模式與U251/N外泌體的蛋白質組模式不同,它表達較低的KRT,H2AX和較高的Rap1和F-肌動蛋白。白藜蘆醇可以通過改變KRT,H2AX,Rap1,F-肌動蛋白和G蛋白等蛋白的表達,進而改變U251和LN428細胞的蛋白質組學模式。6.基于GO功能聚類分析的蛋白質生物信息學分析發(fā)現(xiàn),在生物過程中,U251/N外泌體在染色質沉默和表皮發(fā)育中具有更高的表達,而U251/Res外泌體含有更多參與氧轉運、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路和細胞蛋白代謝過程的蛋白質。分子功能分析表明,U251/N外泌體更多地作用在蛋白質異二聚化活性和DNA結合。U251/Res外泌體蛋白在G蛋白復合物結合、脒基核苷酸結合和GTP酶活性上比U251/N外泌體有更高的表達。LN428/N外泌體與LN428/Res外泌體有多個共同參與關鍵生物過程和分子功能的蛋白質。經(jīng)篩選,前5個生物過程分別是核小體組裝,基于微管的過程,染色質沉默,細胞骨架組織和氧運輸。此外,分子功能活性中豐富度最高的是細胞骨架的結構成分和酶活性(包括結構分子活性,蛋白質異二聚化活性,GTP酶活性和氧轉運活性)。7.借助KEGG信號通路富集分析結果顯示,U251/N外泌體可能通過調節(jié)Rap1信號通路與壞死性凋亡通路來增強耐藥的LN428細胞對白藜蘆醇的藥物敏感性。結論:1.白藜蘆醇敏感的膠質瘤細胞U251在藥物處理后外泌活性更高。2.來自白藜蘆醇敏感U251膠質瘤細胞的外泌體含有更多H_2AX和更低的Rab1,F-肌動蛋白和G蛋白,它能提高LN428對白藜蘆醇的藥物敏感性。3.白藜蘆醇可以增加處理膠質瘤細胞的外泌體耐藥蛋白水平,而不論其藥物敏感性如何。
【圖文】：

示生長停滯和廣泛的細胞死亡。而在 LN428 細胞系，細胞狀態(tài)良好，形態(tài)未發(fā)生明顯改變，細胞群中較為旺盛（圖 1A）。 LN428 細胞系在白藜蘆醇處理后 MTT 檢測結果 U251、LN428 膠質瘤細胞的抑制作用使用 MTT 結果養(yǎng)組和 0.1%DMSO 處理組的細胞進行比較。MTT 細μM 白藜蘆醇處理 48h 的 U251 細胞的 OD 值（OD=0），與未受藥物處理的對照組（OD=0.618+0.103，p具有顯有統(tǒng)計學差異；而經(jīng)過 48h，100μM 白藜蘆醇0.743+0.047）和未處理細胞（OD=0.722+0.185，p =化。這些結果表明 U251 膠質瘤細胞系對白藜蘆醇胞系。

圖 2. 支原體檢測：細胞 Hochest DNA 染色。U251 和 LN428 細胞制備外泌體及鑒定51 或 LN428 細胞的上清液中純化外泌體，定SO-處理的樣品為 DMSO/外泌體，白藜蘆醇處電鏡觀察U251及LN428兩細胞系提取的外泌的是差速超速離心法得到的外泌體，可見外形的膜結合囊泡。大小較均一，背景清晰，且僅析技術結果顯示，外泌體大小分布為 30nm-2粒跟蹤分析技術的外泌體定量結果顯示，白藜的 U251 細胞外泌體分泌增長 415.9％，，而對有 12.1％。對于上述方法分離得到的 2 種膠質取蛋白，采用 Western Blot 實驗檢測外泌體標
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R739.41

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本文編號：2709911