【摘要】：目的:腦缺血損傷是一種由多因素引起的神經(jīng)疾病,常常會導(dǎo)致認(rèn)知和記憶障礙,至今尚無有效的療法。腦缺血會引起海馬神經(jīng)元死亡和細胞骨架系統(tǒng)異常。到目前為止,腦缺血后細胞骨架在神經(jīng)元死亡進程中的具體變化仍不清楚。微管和肌動蛋白纖維(F-actin)是兩種重要的細胞骨架,在神經(jīng)元生長發(fā)育過程中扮演著重要的角色。本課題采用短暫性四動脈全腦缺血模型,檢測微管和肌動蛋白纖維在缺血再灌注不同時間點的形態(tài)學(xué)變化,同時檢測微管和肌動蛋白纖維相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的表達情況,從而探討缺血再灌注之后微管和肌動蛋白纖維在神經(jīng)元延遲性死亡進程中的變化規(guī)律。方法:本實驗采用短暫性四動脈全腦缺血13min再灌注模型,通過NeuN染色和F-JB染色檢測神經(jīng)元損傷情況,應(yīng)用鬼筆環(huán)肽特異性檢測海馬中F-actin的變化,應(yīng)用MAP2和β-Tubulin檢測海馬中微管的變化;應(yīng)用western blot技術(shù)檢測全海馬中cofilin、p-cofilin、β-Tubulin以及acetylatedαTubulin蛋白的表達情況。在此基礎(chǔ)上通過體外實驗直接檢測微管和肌動蛋白纖維的形態(tài)學(xué)變化,從整體上探討缺血再灌注后微管和F-actin在海馬神經(jīng)元延遲性死亡進程中的變化規(guī)律。結(jié)果:1、NeuN、F-JB以及MAP2免疫熒光染色結(jié)果顯示:海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元在缺血再灌注第2天死亡,隨著時間的延長逐漸加重,在缺血再灌注第7天神經(jīng)元死亡數(shù)量達到最大。2、鬼筆環(huán)肽檢測技術(shù)揭示F-actin降解進程與海馬神經(jīng)元死亡進程一致。海馬CA1區(qū)F-actin在缺血再灌注第2天明顯損傷;在缺血再灌注第3天到第7天,F-actin損傷逐漸加重。此外在缺血再灌注第2天到第3天,海馬CA1區(qū)輻射層中的F-actin典型的點狀結(jié)構(gòu)消失。3、Western blot檢測cofilin和p-cofilin蛋白表達情況,結(jié)果顯示:cofilin的表達水平在缺血再灌注第3天和第7天逐漸增高,然而p-cofilin的表達水平卻逐漸降低。4、β-Tubulin的免疫熒光染色結(jié)果顯示:與假手術(shù)組相比,海馬CA1區(qū)輻射層中β-Tubulin的表達在缺血再灌注第1天輕微下降,第2天顯著降低,之后進行性減少并消失。5、Western blot檢測β-Tubulin和acetylatedαTubulin蛋白表達情況,結(jié)果顯示:與假手術(shù)組相比,缺血組全海馬中β-Tubulin的蛋白表達水平變化并不顯著,但是acetylatedαTubulin的蛋白表達水平卻在缺血再灌注第3天降低,在缺血再灌注第7天顯著減少。6、體外實驗結(jié)果顯示:海馬神經(jīng)元用細胞松弛素D處理后,F-actin發(fā)生降解,MAP2相應(yīng)減少,隨著作用時間的延長,二者的損傷情況逐漸加重;海馬神經(jīng)元用諾考達唑處理后,MAP2和F-actin均減少,并隨著作用時間的延長逐漸加重。結(jié)論:1、全腦缺血再灌注后,F-actin和微管進行性解聚,其空間演變和時間變化與海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷相一致。2、缺血再灌注后激活的cofilin可能參與F-actin的解聚。3、微管乙酰化表達水平在缺血再灌注后降低,可能與微管的斷裂有關(guān)。
【圖文】：

H 圖-N 圖為 F-JB 染色，O 圖-U 圖為 MAP2 染色。Scale Bars：500μm。海馬 CA1 區(qū)錐體層中 NeuN 的免疫熒光在假手術(shù)組中很容易檢測到，但是在缺血再灌注之后卻逐漸減少(A 圖-G 圖)。NeuN 的熒光強度和陽性顆粒在缺血再灌注第 2 天到第 3 天顯著降低，在第 7 天達到頂峰，意味著此時神經(jīng)元死亡最多。F-JB 染色顯示在缺血再灌注第 2 天出現(xiàn) F-JB 陽性細胞，一直持續(xù)到缺血再灌注第 7 天(H 圖-N 圖)。海馬 CA1 區(qū)和門區(qū)MAP2 的熒光強度在缺血再灌注之后隨著時間的推移逐漸減少(O 圖-U 圖)。

圖 3.2 缺血再灌注不同時期海馬 CA1 區(qū)的高倍鏡照片。A 圖-G 圖為 NeuN 染色，H 圖-N 圖為 F-JB 染色，O 圖-U 圖為 MAP2 染色。Scale bar：50μm。在假手術(shù)組中，海馬錐體層中 NeuN 的陽性染色很容易檢測到，但是缺血再灌注之后，NeuN 熒光強度卻逐漸下降，其中在缺血再灌注 7 天時降到最低(A 圖-G 圖)。海馬 CA1 錐體層在缺血再灌注第 2 天有很多 F-JB 陽性細胞，，一直持續(xù)到缺血再灌注第 7 天(H 圖-N 圖)。海馬 CA1 區(qū) MAP2 的熒光強度在缺血再灌注之后隨著時間的推移逐漸減少(O 圖-U 圖)。V 圖是缺血再灌注不同時間點海馬 CA1 區(qū)錐體層 NeuN 的陽性細胞的平均數(shù)量統(tǒng)計結(jié)
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R743

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 吳剛;薛榮亮;呂建瑞;李偉;雷曉鳴;;全腦缺血再灌注后Fas、TNFR1蛋白的表達與細胞凋亡的關(guān)系及Bcl-2過度表達對其的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2011年08期

本文編號：2707308