【摘要】：研究背景腓骨肌萎縮癥(Charcot-Marie-Tooth disease,CMT)是最常見的周圍性神經(jīng)變性病之一,亦稱為遺傳性運(yùn)動(dòng)感覺神經(jīng)病,人群患病率為1/2500。CMT具有高度的臨床以及遺傳異質(zhì)性,其典型的臨床表現(xiàn)是對稱性肢體遠(yuǎn)端肌無力與肌萎縮、異常步態(tài)、鶴腿樣畸形、弓形足、錘狀趾以及深腱反射減弱或消失,有時(shí)感覺功能也會(huì)受累。根據(jù)神經(jīng)電生理特點(diǎn),CMT可分為脫髓鞘型和軸索型:脫髓鞘型,即 CMT1 型,運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速率(Motor nerve conduction velocity,MNCV)明顯降低,一般小于38m/s,且伴有脫髓鞘病變;軸索型,即CMT2型,MNCV正�；蚪咏�,伴隨軸突退行性變;MNCV位于35-45 m/s之間的患者被稱為中間型。CMT遺傳方式多樣,可呈常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳,也可呈X連鎖遺傳。根據(jù)遺傳方式及致病基因/位點(diǎn)不同,CMT又可分為不同的亞型,各亞型的臨床表現(xiàn)不盡相同。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,迄今為止,已發(fā)現(xiàn)70多個(gè)基因/位點(diǎn)的突變與CMT的發(fā)生有關(guān)。外周神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的兩種組分是神經(jīng)元及包裹在神經(jīng)元軸突外面的髓鞘,而髓鞘膜的形成及結(jié)構(gòu)的維持有賴于施萬細(xì)胞正常功能的發(fā)揮。某些致病基因突變后會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生錯(cuò)誤折疊,并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)異常聚集,引起未折疊蛋白反應(yīng),從而促進(jìn)了施萬細(xì)胞的凋亡增加,出現(xiàn)脫髓鞘病變,最終導(dǎo)致CMT的發(fā)生。另外,施萬細(xì)胞還可以為神經(jīng)元提供營養(yǎng)支持,對于神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的維持及功能的發(fā)揮也具有重要的作用,所以當(dāng)外周神經(jīng)發(fā)生脫髓鞘病變后會(huì)繼發(fā)軸突結(jié)構(gòu)異常及功能缺失,即軸突變性。相比脫髓鞘本身而言,軸突變性與疾病的臨床表現(xiàn)具有更加密切的聯(lián)系。某些致病基因突變后會(huì)直接影響軸突的發(fā)育或者正常的軸突運(yùn)輸,從而引起軸突退行性變,導(dǎo)致疾病的發(fā)生。神經(jīng)絲(Neurofilaments,NFs)是一種直徑為10nm的中間絲。根據(jù)分子量的大小,可分為神經(jīng)絲蛋白輕鏈(Neurofiilament light chain,NEFL)、神經(jīng)絲蛋白中鏈(Neurofilament medium chain,NEFM)及神經(jīng)絲蛋白重鏈(Neurofilament heavy chain,NEFH)。神經(jīng)絲蛋白在神經(jīng)元胞體內(nèi)形成,隨后運(yùn)輸至軸突,與微管蛋白等其他細(xì)胞骨架蛋白裝配形成纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),其對于軸突的生長、軸突直徑的維持以及電沖動(dòng)沿軸突的傳導(dǎo)具有非常重要的作用。有研究證實(shí),NEFL基因突變后會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)絲在胞體發(fā)生異常聚集,破壞正常網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成,引起軸突運(yùn)輸障礙及軸突退行性變,最終導(dǎo)致CMT2E的發(fā)生。NEFM中的變異與帕金森病(Parkinson's disease,PD)的發(fā)生有關(guān)。此外,NEFH基因突變后會(huì)導(dǎo)致肌萎縮性側(cè)索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS),也是一種常見的退行性神經(jīng)病。綜上,神經(jīng)絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的正常裝配對于軸突的發(fā)育及運(yùn)輸功能意義重大,編碼神經(jīng)絲蛋白的基因發(fā)生突變后會(huì)引起軸突變性最終導(dǎo)致多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。研究目的1.對采集到的一常染色體顯性遺傳的CMT家系致病基因進(jìn)行分離;2.在體外及體內(nèi)水平進(jìn)行驗(yàn)證,明確突變的致病機(jī)制。研究方法1.將該CMT家系中所有成員進(jìn)行全基因組掃查,其中兩個(gè)患者進(jìn)行全外顯子組測序;2.構(gòu)建野生型及突變型NEFH病毒表達(dá)載體,構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)野生型及突變型NEFH的細(xì)胞系。利用免疫熒光檢測細(xì)胞中神經(jīng)絲分布情況。3.利用嗎啉反義寡核苷酸(Morpholino antisense oligonucleotides,MOs)構(gòu)建nefh knockdown斑馬魚模型,對胚胎的大體形態(tài)及運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行觀察,利用免疫組化及免疫熒光檢測神經(jīng)元軸突發(fā)育情況。構(gòu)建pCS2-NEFH以及pCS2-NEFH-Mut真核表達(dá)載體,線性化后體外轉(zhuǎn)錄獲得人野生型及突變型NEFH mRNA,與nefh MOs共注射,觀察斑馬魚胚胎表型。4.構(gòu)建人突變型NEFH轉(zhuǎn)基因小鼠模型以及突變型Nefh knock-in小鼠模型。利用轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)、跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)及握力實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)檢測。對小鼠的電生理特征進(jìn)行檢測,包括神經(jīng)傳導(dǎo)速率與復(fù)合肌肉動(dòng)作電位。利用HE染色進(jìn)行肌肉病理檢測。利用透射電鏡對突變型Nefh knock-in小鼠坐骨神經(jīng)進(jìn)行組織學(xué)分析。結(jié)果1.一腓骨肌萎縮癥家系致病基因NEFH的分離鑒定我們采集到一 CMT家系,該家系一共三代,每一代都出現(xiàn)發(fā)病患者,而且男女均有發(fā)病,呈常染色體顯性遺傳,臨床診斷為CMT2型。該家系中有7名患者,10名正常人�；颊叽蠖酁�20歲左右發(fā)病,典型表現(xiàn)是下肢出現(xiàn)肌萎縮和肌無力、腱反射減弱或消失并逐漸累及上肢、足部畸形即出現(xiàn)弓形足,但感覺功能未受累。為了分離該家系的致病基因,我們首先排除了已知的CMT致病基因,然后利用Illumina SNP芯片對家系中所有成員進(jìn)行全基因組掃查,對常染色體上872,261個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(Single nucleotide polymorphism,SNP)進(jìn)行基因分型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在2號染色體171204750-173914775和22號染色體28866225-36418280區(qū)域得到大于2的LOD值,提示連鎖,最大LOD值分別為2.3543和2.3541,其他染色體均未出現(xiàn)LOD值大于2的區(qū)域,這提示該家系的致病基因位于以上兩個(gè)連鎖區(qū)域內(nèi)。隨后,我們分別對這兩個(gè)候選區(qū)域進(jìn)行了單體型分析,發(fā)現(xiàn)與家系中患者的表型共分離。與此同時(shí),我們選取了親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的兩個(gè)患者進(jìn)行了全外顯子組測序(Whole-exome sequencing,WES)。我們將兩個(gè)患者共有且位于以上連鎖區(qū)域內(nèi)的變異作為候選突變。結(jié)果發(fā)現(xiàn),2號染色體連鎖區(qū)域不存在符合條件的變異,而22號染色體則包含四個(gè)候選變異,分別是NEFH(c.1937_1938insAAGTCCCCTGAGAAGGCC)、NEFH(c.2229_2248delGCTAAGTCCCCAGAGAAG)、NEFH(c.3057insG)以及APOL6(c.824 CA)。經(jīng)比對,以上突變均不存在于千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫中。但是,NEFH中第一個(gè)候選變異為純合突變,而該CMT家系呈常染色體顯性遺傳,故予以排除;NEFH中第二個(gè)候選變異在外顯子集合數(shù)據(jù)庫(Exome Aggregation Consortium,ExAC)中為多態(tài)位點(diǎn);而且ExAC數(shù)據(jù)庫中包含APOL6(c.824 CA)的突變,根據(jù)其變異頻率與疾病發(fā)生率并不相符,同樣予以排除。這提示NEFH(c.3057insG)最可能為該CMT家系的致病基因。隨后,我們利用Sanger測序在家系其他成員中進(jìn)行了檢測,結(jié)果表明,該插入突變在家系中與表型共分離,即患者均攜帶該位點(diǎn)的突變而正常人均不攜帶。綜上所述,我們將該常染色體顯性遺傳CMT家系的致病基因初步確定為NEF(c.3057 ins G,p.Lys 1020Glufs*43)。神經(jīng)絲主要在神經(jīng)元胞體內(nèi)合成,然后沿軸突運(yùn)輸至遠(yuǎn)端。正常情況下,在外周神經(jīng)系統(tǒng),NEFL、NEFM、NEFH和外周蛋白會(huì)裝配形成神經(jīng)絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),這對于細(xì)胞骨架的維持及軸突的生長具有非常重要的作用。研究表明,NEFL發(fā)生突變后會(huì)引起神經(jīng)絲蛋白在胞體內(nèi)發(fā)生異常聚集,不能運(yùn)送至軸突遠(yuǎn)端,正常網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)遭到破壞,引發(fā)軸突變性,最終導(dǎo)致CMT的發(fā)生。此外,NEFH突變會(huì)引起神經(jīng)元胞體出現(xiàn)異常淀粉樣聚集,是肌萎縮性側(cè)索硬化癥(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)典型的病理改變。近期研究發(fā)現(xiàn),NEFH發(fā)生移碼突變導(dǎo)致終止密碼子缺失,3'UTR中延長的氨基酸會(huì)編碼與ALS病理改變相似的纖維淀粉樣物質(zhì)CAEs(cryptic amyloidogenic elements),引起突變型蛋白在胞質(zhì)出現(xiàn)異常聚集。為了進(jìn)一步明確突變型NEFH的功能及其致病機(jī)制,我們構(gòu)建了野生型及突變型NEFH慢病毒表達(dá)載體。為了避免內(nèi)源性神經(jīng)絲的干擾,我們選擇不表達(dá)內(nèi)源性神經(jīng)絲的SW13(vim-)細(xì)胞進(jìn)行病毒感染,利用嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定高表達(dá)野生型或者突變型NEFH的細(xì)胞系。由于NEFH必須與NEFL結(jié)合才能裝配形成直徑10 nm的神經(jīng)絲,所以我們將野生型NEFL表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入穩(wěn)定高表達(dá)野生型或突變型NEFH的SW13(vim-)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,利用NEFH特異性抗體進(jìn)行標(biāo)記,通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測神經(jīng)絲的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在穩(wěn)定高表達(dá)野生型NEFH的細(xì)胞中,綠色熒光在胞質(zhì)中均勻彌散分布,而高表達(dá)突變型NEFH的細(xì)胞中出現(xiàn)了綠色熒光的聚集,與之前的研究發(fā)現(xiàn)一致,這提示突變型NEFH的表達(dá)可能引起突變型蛋白的異常聚集,破壞了神經(jīng)絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成以及正常功能的發(fā)揮,從而導(dǎo)致疾病發(fā)生。2.利用斑馬魚模型明確突變型NEFH的致病性斑馬魚的神經(jīng)系統(tǒng)在短時(shí)間內(nèi)就可以發(fā)育完全而且較易觀察,所以常被作為模式動(dòng)物對神經(jīng)退行性疾病的致病機(jī)制進(jìn)行研究。因此,我們針對nefh第二外顯子和第一內(nèi)含子的剪接位點(diǎn)設(shè)計(jì)了嗎啉反義寡核苷酸(Morpholino antisense oligonucleotides,MOs),將其顯微注射至1～2細(xì)胞期斑馬魚胚胎中構(gòu)建了nefh-knockdown斑馬魚模型。以存在5個(gè)錯(cuò)配堿基的control MO作為對照,在受精后48小時(shí)觀察胚胎表型是否出現(xiàn)改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn),顯微注射1 pmol control MO的斑馬魚胚胎表型與野生型相比沒有明顯差異,而顯微注射等量的nefh MOs的胚胎出現(xiàn)了尾部發(fā)育畸形,表現(xiàn)為不同程度地彎曲。由于CMT患者的典型臨床表現(xiàn)是雙下肢對稱性肌萎縮、無力,所以我們對受精后48小時(shí)的斑馬魚胚胎的運(yùn)動(dòng)能力,即觸碰誘發(fā)的游泳運(yùn)動(dòng)進(jìn)行了檢測。野生型及顯微注射control MO的胚胎對于觸碰十分敏感,引發(fā)快速游泳運(yùn)動(dòng),而注射nefh MOs的胚胎對觸碰不敏感甚至完全沒有反應(yīng),運(yùn)動(dòng)能力顯著下降,提示nefh敲低后斑馬魚胚胎的運(yùn)動(dòng)能力受到損害。神經(jīng)絲對于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突的發(fā)育起到關(guān)鍵作用,CMT2型患者典型的病理表現(xiàn)是軸突變性,所以我們利用Znp-1特異性抗體對受精48小時(shí)胚胎的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突進(jìn)行標(biāo)記檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),顯微注射control MO的胚胎神經(jīng)元軸突從背側(cè)發(fā)出,垂直延伸至腹側(cè),而注射mefh MOs的胚胎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突發(fā)育異常,出現(xiàn)截短或者分叉的現(xiàn)象,甚至完全不發(fā)育。隨后我們利用乙酰化α-tubulin抗體進(jìn)行斑馬魚全胚免疫熒光檢測也觀察到了同樣的結(jié)果,提示nefh的缺失影響了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突的生長從而導(dǎo)致了胚胎運(yùn)動(dòng)能力的降低。以上結(jié)果僅能證明NEFH對運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有作用,但并不能驗(yàn)證NEFH(p.Lys1020Glufs*43)具有致病效應(yīng),為了明確NEFH的突變是否具有致病性,我們將人野生型NEFH mRNA與nefh MOs共同顯微注射入1～2細(xì)胞期斑馬魚胚胎中進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),胚胎的表型完全或者部分恢復(fù)正常,出現(xiàn)尾部畸形的胚胎比例明顯降低,而且胚胎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突發(fā)育部分恢復(fù)正常,出現(xiàn)截短或分叉的軸突比例顯著降低,這提示人野生型NEFF mRNA能夠代償內(nèi)源性nefh的缺失。但是,人突變型NEFH mRNA與nefh MOs共注射的胚胎仍然會(huì)出現(xiàn)尾部發(fā)育畸形,而且與單獨(dú)注射nefh MOs的胚胎相比,出現(xiàn)軸突生長缺陷,即軸突截短或分叉的胚胎比例并沒有出現(xiàn)降低,這表明人突變型NEFH mRNA不能拯救內(nèi)源性nefh缺失所引起的異常表型,也證實(shí)了突變型NEFH的致病性。這進(jìn)一步證實(shí)了NEFH發(fā)生突變后會(huì)影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突的發(fā)育及正常功能的發(fā)揮,從而引起軸突變性,導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。3.利用小鼠模型對NEFH致病機(jī)制的研究為了進(jìn)一步探討NEFH突變的分子病理效應(yīng),我們構(gòu)建了人突變型NEFH(mNEFH)轉(zhuǎn)基因小鼠模型。首先,我們通過轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)對小鼠的行為學(xué)進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與野生型(wild-type,WT)小鼠相比,人mNEFH轉(zhuǎn)基因小鼠并沒有出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)能力的降低。隨后,我們利用握力實(shí)驗(yàn)對小鼠的肌力進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因小鼠也沒有出現(xiàn)肌無力等典型的神經(jīng)退行性病變。轉(zhuǎn)基因小鼠的MNCV與野生型小鼠相比沒有出現(xiàn)降低,而且復(fù)合肌肉動(dòng)作電位(Compound muscle action potential,CMAP)振幅及時(shí)程也沒有明顯改變。此外,肌肉病理檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因小鼠的腓腸肌肌纖維排列整齊,沒有出現(xiàn)形態(tài)異常或者肌肉萎縮。綜上結(jié)果表明,人mNEFH轉(zhuǎn)基因小鼠沒有出現(xiàn)類似于CMT患者或者其它動(dòng)物模型所表現(xiàn)的退行性改變。隨后,我們又構(gòu)建了突變型Nefh(mNefh)knock-in小鼠模型。行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)mNefh knock-in雜合小鼠運(yùn)動(dòng)能力與野生型小鼠沒有明顯差異,而且肌力正常。電生理檢測表明,mNefh knock-in雜合小鼠MNCV沒有出現(xiàn)降低,且CMAP振幅和時(shí)程均正常。肌肉病理檢測顯示腓腸肌肌纖維排列正常,沒有出現(xiàn)萎縮或肥大以及CMT典型的核固縮現(xiàn)象。除此之外,透射電鏡檢測提示mNefh knock-in雜合小鼠坐骨神經(jīng)神經(jīng)元軸突數(shù)量減少,但軸突直徑分布正常,神經(jīng)絲密度并未出現(xiàn)明顯降低,軸突直徑與纖維直徑之比(g-ratio)也無異常改變。盡管斑馬魚中內(nèi)源性nefh的缺失能夠引起運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突變性,但是兩種小鼠模型沒有表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)退行性疾病的典型癥狀。這與之前Nefh基因敲除小鼠模型并未有明顯的臨床表型是一致的,可能與疾病發(fā)病年齡較晚以及疾病的異質(zhì)性有關(guān)系。創(chuàng)新性和意義本研究發(fā)現(xiàn)了 NEFH中一新的突變位點(diǎn),其可以引起神經(jīng)絲發(fā)生異常聚集,不能形成正常的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致CMT2CC的發(fā)生,進(jìn)一步揭示了 CMT的發(fā)病機(jī)制,為疾病的基因診斷奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

ＰＣＲ邋（Ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ＰＣＲ，，ＬＭ－ＰＣＲ）對純化的邋ＤＮＡ邋進(jìn)行擴(kuò)增。利用邋Ａｇｉｌｅｎｔ逡逑２１００液相分析系統(tǒng)對捕獲的外顯子區(qū)域ＤＮＡ進(jìn)行富集，然后在Ｈｉｓｅｑ２０００平臺(tái)逡逑進(jìn)行高通量測序，操作流程如圖１－２。根據(jù)以下條件對得到的突變位點(diǎn)進(jìn)行篩選：逡逑①突變必須為雜合突變；②ＭＡＦ小于０．０５％；③ＩＩＩ４和ＩＩ１均攜帶。逡逑３３逡逑

ＩＩＭ逡逑候選區(qū)域逡逑圖１－１全基因組掃查逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ邋ｓｃａｎｎｉｎｇ逡逑２．４全外顯子組測序逡逑將家系中ＩＩＩ４和ＩＩＩ的ＤＮＡ樣本送至華大基因進(jìn)行全外顯子組測序。將純化的逡逑基因組ＤＮＡ樣本隨機(jī)打斷，片段長度主要在１５０邋ｂｐ－２００邋ｂｐ之間。通過連接介導(dǎo)逡逑ＰＣＲ邋（Ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ＰＣＲ，ＬＭ－ＰＣＲ）對純化的邋ＤＮＡ邋進(jìn)行擴(kuò)增。利用邋Ａｇｉｌｅｎｔ逡逑２１００液相分析系統(tǒng)對捕獲的外顯子區(qū)域ＤＮＡ進(jìn)行富集，然后在Ｈｉｓｅｑ２０００平臺(tái)逡逑進(jìn)行高通量測序，操作流程如圖１－２。根據(jù)以下條件對得到的突變位點(diǎn)進(jìn)行篩選：逡逑①突變必須為雜合突變；②ＭＡＦ小于０．０５％；③ＩＩＩ４和ＩＩ１均攜帶。逡逑３３逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R746.4


本文編號：2696355