【摘要】：目的:探討MAGE-D4啟動子甲基化和轉(zhuǎn)錄因子Sp1對MAGE-D4啟動子活性的影響。方法:1.生物信息學(xué)分析:通過公共數(shù)據(jù)庫查詢分析MAGE-D4啟動子區(qū)域及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),MAGE-D4/Sp1表達(dá)及相關(guān)性等。2.甲基化質(zhì)譜分析:提取50例膠質(zhì)瘤組織和9例正常腦組織DNA,檢測MAGE-D4啟動子區(qū)域CpG位點(diǎn)甲基化水平。3.熒光素酶報告基因質(zhì)粒構(gòu)建:根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果,構(gòu)建5個不同截短MAGE-D4啟動子熒光素酶報告基因載體(pGL3-P1~P5)。4.熒光素酶活性檢測(Luciferase assay):將構(gòu)建好的pGL3-P1~P5轉(zhuǎn)染細(xì)胞,檢測熒光素酶活性,篩選MAGE-D4核心啟動子區(qū)域;用已篩選出的pGL3-p進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗。5.實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR):提取細(xì)胞總RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,cDNA經(jīng)管家基因擴(kuò)增檢測質(zhì)量后,用于檢測Sp1 mRNA和MAGE-D4 mRNA。6.蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot):提取細(xì)胞核蛋白,用于檢測Sp1蛋白表達(dá)。7.染色質(zhì)免疫共沉淀-qPCR(ChIP-qPCR):Sp1抗體富集DNA/Sp1蛋白復(fù)合物,然后qRT-PCR擴(kuò)增,檢測Sp1與MAGE-D4啟動子的結(jié)合。結(jié)果:1.生物信息學(xué)分析顯示,MAGE-D4啟動子序列具有Sp1等多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),其相對核心啟動子區(qū)域含4個Sp1潛在結(jié)合位點(diǎn)并與甲基化位點(diǎn)重合;膠質(zhì)瘤中MAGE-D4和Sp1表達(dá)較高,正常組織中表達(dá)較低,二者具有一定的共表達(dá)相關(guān)性。2.MAGE-D4核心啟動子區(qū)域的確定:通過構(gòu)建5個不同截短MAGE-D4啟動子報告基因載體,進(jìn)行熒光素酶報告基因載體活性檢測,篩選出-358~+172 bp區(qū)域為MAGE-D4基因的相對核心啟動子。3.質(zhì)譜分析結(jié)果顯示,膠質(zhì)瘤樣本中MAGE-D4啟動子區(qū)域平均總體甲基化頻率低于正常腦組織樣本。4.Luciferase assay結(jié)果顯示,啟動子甲基化降低MAGE-D4啟動子活性。5.Luciferase assay和qRT-PCR結(jié)果顯示,Sp1能夠增強(qiáng)MAGE-D4啟動子活性并促進(jìn)MAGE-D4轉(zhuǎn)錄。6.ChIP-qPCR證實(shí)Sp1直接結(jié)合于MAGE-D4啟動子區(qū)域;DAC處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞株后,能提高Sp1與MAGE-D4啟動子的結(jié)合能力。7.Luciferase assay結(jié)果顯示,非甲基化的MAGE-D4啟動子,再轉(zhuǎn)染pcDNA-Sp1,報告基因載體顯示出相對最高的啟動子活性,提示Sp1和去甲基化存在協(xié)同作用共同提高了MAGE-D4啟動子活性。結(jié)論:1.MAGE-D4相對核心啟動子區(qū)域為-358~+172 bp;2.MAGE-D4啟動子活性與其甲基化狀態(tài)有關(guān);3.轉(zhuǎn)錄因子Sp1能活化MAGE-D4啟動子并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄;4.去甲基化和Sp1協(xié)同提高M(jìn)AGE-D4啟動子活性。
【圖文】：

中啟動子甲基化和轉(zhuǎn)錄因子 Sp1 對 MAGE-D4 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用 2018 屆碩士-TK 質(zhì)粒（Promega 公司）結(jié)構(gòu)如圖 1-2 所示；pRL-TK酶基因序列，，用于 pGL3-Basic 質(zhì)粒的實(shí)驗對照。

pRL-TK質(zhì)粒示意圖
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4

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本文編號：2693314