【摘要】：目的:蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)主要是由顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂引起,是神經(jīng)外科的一種危重疾病,致死率高達(dá)50%,致殘率高達(dá)30%。大量的SAH患者罹患繼發(fā)性腦缺血和遲發(fā)性腦梗塞;遲發(fā)性腦缺血被認(rèn)為是SAH患者預(yù)后較差的主要原因。當(dāng)前研究則認(rèn)為,SAH后腦血流自動(dòng)調(diào)節(jié)受損可能是引起遲發(fā)性腦缺血的更根本的機(jī)制。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的基本結(jié)構(gòu)和功能組成成分,可以通過調(diào)節(jié)腦血管舒縮功能在腦血流自動(dòng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性是腦血流自動(dòng)調(diào)節(jié)的前提。SAH后炎癥反應(yīng)可以破壞腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整性。脂氧素A4(lipoxin A4,LXA4)是機(jī)體內(nèi)重要的內(nèi)源性脂質(zhì)抗炎和促炎癥消退介質(zhì),已證實(shí)能抑制SAH后中性粒細(xì)胞的聚集與粘附。在本研究中,通過構(gòu)建大鼠實(shí)驗(yàn)性SAH模型,研究LXA4對(duì)腦血管內(nèi)皮功能的保護(hù)作用以及探討其在SAH后腦血流調(diào)節(jié)中的作用,并初步探討其潛在的機(jī)制,為臨床SAH的治療提供新思路。方法:1、選用SD雄性大鼠,使用血管內(nèi)穿刺法構(gòu)建假手術(shù)和SAH模型,在SAH后通過激光多普勒血流儀監(jiān)測(cè)大鼠腦血流(Cerebral blood flow,CBF)的變化。抽取各組大鼠動(dòng)脈血液標(biāo)本,流式細(xì)胞儀用于檢測(cè)血液中內(nèi)皮微粒的表達(dá)水平。利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)SAH后腦血管中LXA4的含量,明確內(nèi)皮功能損傷最嚴(yán)重的時(shí)間點(diǎn)以及LXA4在血管中表達(dá)的差異。2、構(gòu)建SD大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺SAH模型,在內(nèi)皮損傷最嚴(yán)重時(shí)間點(diǎn),通過側(cè)腦室注射外源性LXA4和生理鹽水對(duì)照,使用改良的神經(jīng)功能Garcia評(píng)分檢測(cè)大鼠神經(jīng)功能的變化。通過檢測(cè)Evans Blue(EB)的滲出率來觀察SAH后血腦屏障(Blood brain barrier,BBB)通透性的變化,使用腦組織干濕重法檢測(cè)腦水腫的變化。利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)炎癥因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)的表達(dá)水平。使用NO試劑盒檢測(cè)NO的表達(dá)水平,免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)中性粒細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互浸潤情況。取大腦Willis環(huán)和基底動(dòng)脈提取組織蛋白,Western Blot檢測(cè)FPR2、NF-κB、MMP-9、MPO及ICAM-1蛋白的表達(dá)。多普勒血流儀檢測(cè)LXA4干預(yù)后大鼠腦血流的變化。3、血管內(nèi)穿刺法構(gòu)建SD大鼠SAH模型,并通過側(cè)腦室注射FPR2siRNA,Western Blot檢測(cè)FPR2、NF-κB、MMP-9、ERK1/2、MPO和ICAM1的表達(dá),多普勒激光散斑用于檢測(cè)大鼠腦皮層血流的變化,探討LXA4影響SAH后腦血流變化的可能機(jī)制。結(jié)果:1、大鼠SAH后血液中內(nèi)皮微粒表達(dá)水平在6h后逐漸升高,并在24h達(dá)最高水平,并在48h和72h維持高水平,結(jié)果表明SAH后24h是內(nèi)皮損傷最嚴(yán)重時(shí)間點(diǎn)。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,SAH后血管中LXA4表達(dá)水平下降,24h表達(dá)最低。后續(xù)實(shí)驗(yàn)則以24h為觀測(cè)時(shí)間。2、大鼠SAH模型構(gòu)建成功后24h發(fā)現(xiàn)BBB破壞明顯,且伴有嚴(yán)重的腦水腫和腦皮層血流量的減少并可見明顯的神經(jīng)功能障礙。外源性LXA4的干預(yù)處理后,觀察到其明顯緩解BBB通透性的破壞,減輕腦水腫,促進(jìn)腦血流的恢復(fù),改善大鼠SAH后神經(jīng)功能。而使用LXA4受體FPR2的siRNA干預(yù)后上述改善癥狀消失。3、免疫熒光檢測(cè)中性粒細(xì)胞標(biāo)記物(MPO)和血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物(VWF)共染情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SAH后24h后血管MPO與內(nèi)皮細(xì)胞相互浸潤,提示炎癥參與了內(nèi)皮損傷過程。同時(shí)SAH后24h血液中TNF-α,IL-1β,IL-6的表達(dá)水平明顯增高,經(jīng)LXA4干預(yù)后,炎癥因子的表達(dá)受到抑制,中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互浸潤得到緩解。4、LXA4干預(yù)后降低了血液中內(nèi)皮微粒的表達(dá)水平,恢復(fù)了降低的NO水平,減輕了內(nèi)皮功能障礙。同時(shí)在Hb刺激腦血管內(nèi)皮模型發(fā)現(xiàn),內(nèi)皮細(xì)胞活力下降,但LXA4對(duì)其有保護(hù)作用,可以恢復(fù)細(xì)胞活力。5、Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LXA4抑制了SAH后血管的NF-κB、MMP9、ICAM1及MPO的表達(dá),以及抑制了ERK1/2的磷酸化水平;LXA4處理后FPR2表達(dá)水平增高,FPR2 siRNA干預(yù)后部分消除了LXA4的這些作用。結(jié)論:1、大鼠SAH后內(nèi)皮功能受損明顯,并在24h最嚴(yán)重。同時(shí)發(fā)現(xiàn)大鼠腦皮層血流在SAH后較術(shù)前明顯降低。2、LXA4能夠緩解BBB通透性的破壞,減輕腦水腫,促進(jìn)腦血流的恢復(fù),改善大鼠SAH后神經(jīng)功能。3、LXA4促進(jìn)SAH后腦皮層血流的恢復(fù),可能與抑制中性粒細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的浸潤,減輕血管炎癥,緩解內(nèi)皮功能障礙有關(guān)。4、LXA4的保護(hù)作用可能通過FPR2/ERK1/2/NF-κB通路實(shí)現(xiàn)。
【圖文】：

圖 1 大鼠顱底照片。A：Sham 組；B：SAH 組Fig.1. Figure shows representative pictures of sham and SAH圖 2 大鼠 SAH 后 ICP 和 MABP 的變化Fig. 2. Time course of ICP and MABP after SAH in rats

圖 1 大鼠顱底照片。A：Sham 組；B：SAH 組Fig.1. Figure shows representative pictures of sham and SAH
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R743.35

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本文編號(hào)：2685482