【摘要】：近年研究表明,LncRNA通過對(duì).miRNA、蛋白等物質(zhì)的調(diào)節(jié)來影響不同信號(hào)通路,在生命活動(dòng)中起著重要作用。同時(shí),其表達(dá)異常對(duì)腫瘤的發(fā)生和預(yù)后都有著至關(guān)重要的作用。目前,在已發(fā)表的文章中,未發(fā)現(xiàn)Lnc00665的相關(guān)報(bào)道,因此本文對(duì)Lnc00665的功能進(jìn)行研究。課題組前期發(fā)現(xiàn)在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,Lnc00665過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力。為了對(duì)此功能進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn),本論文將從Lnc00665表達(dá)下調(diào)的角度,進(jìn)一步研究Lnc00665對(duì)細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力的影響。我們利用RNAi技術(shù),對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Lnc00665不同位點(diǎn)進(jìn)行干擾,使Lnc00665表達(dá)下調(diào)并構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。通過MTT增殖曲線實(shí)驗(yàn)及克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)Lnc00665表達(dá)下調(diào)時(shí),膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖速度顯著降低;通過細(xì)胞周期、Annexin V/PI雙染實(shí)驗(yàn)和Caspase 3/7活性分析發(fā)現(xiàn),Lnc00665表達(dá)下調(diào)后,細(xì)胞周期時(shí)相被阻滯到G1期,而且細(xì)胞凋亡顯著增加;通過q RT-PCR發(fā)現(xiàn),與細(xì)胞增殖相關(guān)的C-myc表達(dá)量在RNA水平顯著降低。進(jìn)一步利用Transwell小室進(jìn)行遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)Lnc00665表達(dá)下調(diào)時(shí),膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲能力明顯下降;與遷移侵襲相關(guān)的Tenascin-C表達(dá)量顯著降低。由此證明Lnc00665表達(dá)下調(diào)后抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲能力。為了研究Lnc00665的調(diào)控機(jī)制,利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),mi R-1224-5p可能直接與Lnc00665相互作用。利用熒光素酶雙報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn),證實(shí)Lnc00665為miRNA-1224-5p的直接作用靶標(biāo)。為了進(jìn)一步研究miRNA-1224-5p對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響,我們將miRNA-1224-5p mimic轉(zhuǎn)染到膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中,通過MTT增殖曲線和克隆形成分析發(fā)現(xiàn),當(dāng)miRNA-1224-5p過表達(dá)后,U251細(xì)胞增殖能力明顯降低;利用細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn),miRNA-1224-5p過表達(dá)后細(xì)胞周期時(shí)相被阻滯到G1期;同時(shí),應(yīng)用Annexin V/PI雙染實(shí)驗(yàn)與Caspase 3/7的活性分析發(fā)現(xiàn),當(dāng)miRNA-1224-5p過表達(dá)后,細(xì)胞凋亡的數(shù)量顯著增加,而且Lnc00665的過表達(dá)可以明顯回復(fù)miRNA-1224-5p對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng);通過q RT-PCR發(fā)現(xiàn),miRNA-1224-5p過表達(dá)后,C-myc表達(dá)水平明顯降低。進(jìn)一步利用Transwell小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)miRNA-1224-5p過表達(dá)后,膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯下降,Tenascin-C表達(dá)量顯著降低。由此證明miRNA-1224-5p表達(dá)上調(diào)后抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲能力。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明miRNA-1224-5p通過調(diào)控Lnc00665的表達(dá)來抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲能力。本研究為腦膠質(zhì)瘤診斷和治療提供一定的線索。
【圖文】：

搖床上裂解 15min，期間對(duì)細(xì)胞進(jìn)行吹打，保證細(xì)胞裂解完全；④將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至 1.5mL EP 管中，12000 r/min 離心 2min，將上清轉(zhuǎn)移至新的 EP 管中，置于冰上；⑤打開機(jī)器，設(shè)置好程序后，在新的 EP 管中加入 50μL LARⅡ，加入 10μL 細(xì)胞裂解液，吹打 2-3 次，放入機(jī)器中進(jìn)行讀數(shù)；⑥第一次讀數(shù)結(jié)束后，迅速拿出 EP 管，加入 50μL Stop&Glo reagent，吹打 2-3次，放入機(jī)器中再次讀數(shù)，記錄兩次讀數(shù)的值。2.4 生物信息學(xué)預(yù)測網(wǎng)站及分析軟件（1）基因分析軟件：DNAman、primer premier 5、MEGA6；（2）生物信息學(xué)預(yù)測軟件：GeneFriend；（3）圖像分析軟件：GraphPad Prism 5、Photoshop CS6Image Studio、2.5 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線

00665 在腦膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織中瘤組織中表達(dá)水平高于正常腦組織表達(dá)調(diào)對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影 病毒感染 U87 細(xì)胞的效率腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長、黏附依賴、遷源性高表達(dá)的細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)材胞系 U87、U251 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量中可以看出（圖 3-2），Lnc00665的表達(dá)量，因此我們選擇 U87 細(xì)
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2685337