【摘要】：目的:多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)是目前最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤,可發(fā)生于任何年齡,約占所有顱內(nèi)腫瘤的15%,具有惡性程度高、侵襲性強(qiáng)的特性。同時(shí),GBM具有高度異質(zhì)性,預(yù)后極差,臨床上針對(duì)特定分子靶標(biāo)或亞型進(jìn)行精準(zhǔn)診療尤為重要。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-βTGF-β)信號(hào)途徑通過(guò)其腫瘤抑制或促進(jìn)機(jī)制在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。近年來(lái),有研究提出TGF-β通過(guò)microRNA(miRNA)調(diào)節(jié)影響信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。miRNA與TGF-β信號(hào)通路之間存在自動(dòng)調(diào)節(jié)的反饋環(huán)路,通過(guò)相互調(diào)節(jié)作用關(guān)系影響著腫瘤細(xì)胞的生物進(jìn)程。我們利用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β受體(transforming growth factor-βreceptor,TGF-βR)小分子抑制劑對(duì)新鮮切除的臨床組織樣本進(jìn)行藥物處理,利用高通量測(cè)序的方法比較了加藥處理組和對(duì)照組間miRNA表達(dá)譜的差異。在測(cè)序結(jié)果中我們意外地發(fā)現(xiàn)了部分新型miRNA,并在處理和對(duì)照組之間存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究旨在對(duì)所發(fā)現(xiàn)的顯著差異的新型miRNA進(jìn)行篩選鑒定,闡明一新型miRNA在TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)控間的關(guān)系以及在膠質(zhì)瘤中的作用。研究方法:利用高通量測(cè)序結(jié)合stem-loop qRT-PCR(莖環(huán)法引物設(shè)計(jì))和生物信息學(xué)方法對(duì)新型miRNA進(jìn)行驗(yàn)證和分析�；谌四X膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87、原代細(xì)胞和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的PDX小鼠模型,通過(guò)靶基因生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、qRT-PCR及Western blot篩選驗(yàn)證靶基因,經(jīng)模擬物(mimics)或慢病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)行體外功能機(jī)制研究和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果:1.在測(cè)序結(jié)果分析中我們發(fā)現(xiàn)在相應(yīng)的處理組和對(duì)照組間有27個(gè)新型miRNA表達(dá)存在顯著差異,通過(guò)stem-loop qRT-PCR驗(yàn)證篩選出novel_miR 56作為新型miRNA具有顯著差異且受TGF-β通路調(diào)控。2.通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)并分析novel_miR 56可能參與的生物學(xué)進(jìn)程,綜合分析我們篩選出了PRAS40作為novel_miR 56的可能靶mRNA。通過(guò)下游靶基因相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,我們發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,novel_miR 56可通過(guò)與野生型PRAS40 mRNA的3`UTR特異性結(jié)合,調(diào)控PRAS40的mRNA和蛋白水平變化,從而證實(shí)了PRAS40是novel_miR 56的天然靶基因。3.體外增殖實(shí)驗(yàn)顯示novel_miR 56過(guò)表達(dá)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng),并通過(guò)mTOR信號(hào)通路作用于細(xì)胞自噬并影響增殖。4.體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,novel_miR 56過(guò)表達(dá)組較對(duì)照組的腫瘤大小及增長(zhǎng)速度明顯增加,生存時(shí)間短。免疫組化結(jié)果顯示novel_miR 56過(guò)表達(dá)組具有更高的惡性程度,novel_miR 56促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展。結(jié)論:我們的研究結(jié)果驗(yàn)證了在膠質(zhì)瘤中,novel_miR 56作為oncomiR起作用,我們確定了TGFβ-novel_miR 56途徑的下游靶標(biāo)是PRAS40 mRNA,其翻譯蛋白是mTOR激酶的負(fù)調(diào)節(jié)因子,通過(guò)mTOR信號(hào)通路進(jìn)而影響細(xì)胞自噬。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表明novel_miR 56在減弱細(xì)胞自噬水平后促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞增殖。同時(shí),我們的研究也提供了一種新的機(jī)制來(lái)解釋TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)在膠質(zhì)瘤中的促癌作用。
【圖文】：

25通量測(cè)序 miRNA 差異表達(dá)分析結(jié)果（綠色圓點(diǎn)代表顯著圓點(diǎn)為顯著上調(diào)基因，灰色圓點(diǎn)為差異無(wú)顯著性基因）證，我們選取差異顯著下調(diào)的 7 個(gè)新型 miRNA（noovel_miR68、novel_miR93、novel_miR97、novel_miR116、noqRT-PCR 技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，并比較所選 novel_miRs 在各個(gè)細(xì)我們發(fā)現(xiàn)最終有 5 個(gè)新型 miRNA（novel_miR26、noovel_miR97、novel_miR119）被檢測(cè)到，其中 novel_miR56、n較高（見(jiàn)圖 2-2）。

圖 2-2 不同細(xì)胞系（株）中各 miRNA 的相對(duì)表達(dá)豐 miRNA 的測(cè)序結(jié)果，，我們采用與測(cè)序樣本相同的處09761 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行藥物處理，通過(guò)對(duì) U87、N9、LN22loop qRT-PCR 驗(yàn)證結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)只有 novel_miR56中的變化趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果一致，而 novel_miR26、不同細(xì)胞間驗(yàn)證結(jié)果差異較大（見(jiàn)圖 2-3）。
【學(xué)位授予單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R739.4

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本文編號(hào)：2676409