【摘要】：目的:超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子(Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation,HCN)通道是一種病理性疼痛相關(guān)的離子通道,廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),其中包括脊髓背角II層,即脊髓背角膠狀質(zhì)(Substantia gelatinosa,SG)區(qū)。SG區(qū)是整合外周傷害性刺激的初級中樞,在病理性疼痛的發(fā)病過程中,SG神經(jīng)元的興奮性谷氨酸能突觸傳入增強,造成痛覺敏感,即中樞敏化,這是自發(fā)痛和觸誘發(fā)痛等癥狀的主要病理生理學(xué)基礎(chǔ)。本實驗研究了幼年動物中HCN通道在SG神經(jīng)元興奮性突觸前末梢的表達情況,以及此通道對興奮性突觸傳入的調(diào)控機制,以期為兒童病理性疼痛的臨床治療提供新的理論依據(jù)。方法:首先,采用幼年雄性SD大鼠,運用免疫組化技術(shù),選用HCN通道四種亞型的特異性標(biāo)記物Anti-HCN1-4和興奮性軸突末梢標(biāo)記物AntiVGLUT2,觀察HCN1-4亞型在SG區(qū)興奮性軸突末梢的表達情況。然后,制作SD大鼠離體脊髓橫切片(厚400-500mm),運用全細胞膜片鉗技術(shù),記錄SG神經(jīng)元的自發(fā)性(spontaneous)或微小(miniature)興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic currents,EPSCs),觀察HCN通道阻斷劑ZD7288、CsCl以及激動劑forskolin(FSK)等藥物對以上電流的頻率和幅度的作用。最后,采用GAD67-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠(C57/BL6),分別在綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)陽性標(biāo)記的GABA能神經(jīng)元和GFP陰性標(biāo)記的谷氨酸能神經(jīng)元中,觀察上述HCN通道調(diào)節(jié)藥物對不同靶細胞的sEPSCs的作用。在本實驗中,共采用了40只SD大鼠和20只GAD67-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠,為保證實驗的可重復(fù)性,每組實驗至少使用了3只大鼠或小鼠。結(jié)果:免疫組化實驗發(fā)現(xiàn),HCN1-4在SG區(qū)均有表達,其中HCN4亞型在興奮性軸突末梢表達最多(23±3%),其次為HCN1(15±2%)和HCN2(14±2%),而HCN3主要分布于胞質(zhì)內(nèi),在軸突末梢?guī)缀鯚o表達。對SD大鼠的電生理研究發(fā)現(xiàn),在約53%的SG神經(jīng)元中,HCN通道阻斷劑ZD7288(10mM)可分別降低sEPSCs和mEPSCs的頻率至用藥前的63±4%和67±4%,表明其抑制了興奮性的突觸傳入。相反,此通道的激動劑FSK(50mM)可顯著增加mEPSCs的頻率至325±34%,且該作用可被ZD7288部分阻斷。隨后,我們在對幼年GAD67-GFP小鼠的研究中發(fā)現(xiàn),ZD7288和FSK對sEPSCs的調(diào)控作用在GFP陰性的谷氨酸能興奮性神經(jīng)元中有類似的作用,而在GFP陽性的GABA能抑制性神經(jīng)元中卻無明顯作用。結(jié)論:綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)了一種新的HCN通道介導(dǎo)的脊髓背角SG區(qū)痛覺回路興奮性調(diào)控的細胞學(xué)機制,即突觸前HCN通道(尤其是HCN4亞型)可調(diào)控SG神經(jīng)元突觸前末梢釋放谷氨酸,且這些神經(jīng)末梢的相對應(yīng)的突觸后靶點為興奮性,而非抑制性SG神經(jīng)元。
【圖文】：

脊髓橫切片的制備 3-5 周齡的雄性 SD 大鼠或 GAD67-GFP 小鼠，稱重，予腹腔g/kg）麻醉。達到麻醉標(biāo)準后，暴露大鼠（或小鼠）胸前部皮膚劍突，剪開劍突下腹肌暴露腹腔，突破膈肌并迅速離斷雙側(cè)肋灌流針沿心尖方向穿刺至主動脈根部，剪開右心耳，快速用灌待基本置換出血液后，迅速剪開背部皮膚，分離脊柱兩側(cè)的肌肉，并完全浸入預(yù)充氧的 s-ACSF 冰水混合液中。以腹側(cè)入路剪大部為中心游離出脊髓（腰 1-骶 3），于光學(xué)顯微鏡下剝離脊經(jīng)根及軟脊膜。隨后立即將脊髓組織置于瓊脂塊上，用速干膠固定于載物臺上，并迅速將其浸沒于 s-ACSF 冰水混合液中。片頻率為 80 Hz，速度為 0.05 mm/s，調(diào)起止位置，切取 400-5切片（圖 2.1），立即用膠頭滴管將切片移入 32 °C 持續(xù)充氧 液）中孵育至少 30 min，使 SG 神經(jīng)元恢復(fù)至正常生理狀態(tài)。

14圖 3.1HCN1-4 亞型與 VGLUT2 在脊髓背角 II 層的共定位。A-D：HCN1-（4綠色）與 VGLUT2（紅色）在脊髓背角 II 層的染色代表圖，可見 HCN1 和 HCN4 主要呈點狀染色，HCN2 多圍繞胞膜一圈呈環(huán)狀表達，而 HCN3 主要聚集于胞內(nèi)呈團塊狀表達，箭頭所指為共定位。E：HCN1-4 與 VGLUT2 的共染效能統(tǒng)計圖，，提示 HCN4 的共染效能最高，其次為 HCN1 和HCN2，而 HCN3 與 VGLUT2 幾乎無共染。在本圖和以下各圖中，誤差線代表標(biāo)準誤（SEM），*代表 P < 0.05，**代表 P < 0.01。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R741

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Xiao-xue Zhang;Xiao-chun Min;Xu-lin Xu;Min Zheng;Lian-jun Guo;;ZD7288, a selective hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel blocker, inhibits hippocampal synaptic plasticity[J];Neural Regeneration Research;2016年05期

2 宋莉;宋學(xué)軍;;慢性疼痛的研究模型、外周和脊髓機制及臨床治療進展[J];中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志;2015年01期

本文編號：2674925