【摘要】：研究背景多形性膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)是顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤,平均生存時間僅14.6個月。膠質(zhì)母細胞瘤的生長具有較高的侵襲性,因此手術(shù)很難做到完全切除,術(shù)后輔以放療、同步替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)化療成為GBM標準的治療方案。放療是一種通過作用于DNA而殺傷腫瘤細胞的治療方式,因其較好的治療效果和較低的治療成本而在臨床中廣泛應(yīng)用。然而,輻射誘導的DNA損傷可能導致一系列信號傳導途徑的改變,如激活DNA損傷修復,誘導自噬或細胞周期阻滯,增加了腫瘤對這種治療的抵抗力。既往研究表明,對于放療分割方式及劑量的調(diào)整并未使膠質(zhì)母細胞瘤患者生存獲益,而傳統(tǒng)的放療增敏劑如卡鉑等,由于血腦屏障的障礙,它不能有效地到達腫瘤組織發(fā)揮作用。自噬是真核細胞中溶酶體依賴性的自我消化過程。自噬涉及許多過程,首先受損的蛋白質(zhì)和功能障礙的細胞器被包裹成雙層膜的自噬體,自噬體然后與溶酶體融合并被溶酶體中的各種蛋白酶降解。細胞自噬參與機體的多種活動,如適應(yīng)饑餓,抵抗衰老,呈遞抗原,維持遺傳信息穩(wěn)定等。自噬功能障礙可導致多種疾病,如神經(jīng)退行性疾病,心血管疾病和腫瘤。近年來,對放療抵抗的自噬研究越來越多�；A(chǔ)研究表明,放療可以顯著增加腫瘤細胞的自噬水平。因此,放射療法引起的自噬通常被認為是細胞的保護機制,自噬抑制劑有望成為新型放療增敏劑而增強放療的殺傷作用。然而由于血腦屏障的存在,導致很多現(xiàn)存的自噬抑制劑不能夠在腫瘤中達到有效治療濃度。因此尋找一種可用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的新型自噬抑制劑成為急需解決的問題。三氟拉嗪是一種經(jīng)典的吩噻嗪類抗精神藥物,其在臨床中已經(jīng)有50余年的應(yīng)用歷史。三氟拉嗪的主要適應(yīng)癥是精神分裂,能夠改善行為異�；颊叩慕乖瓴话舶Y狀,還有止吐等作用。近年來,有較多的基礎(chǔ)研究表明三氟拉嗪在治療包括肺癌、惡性周圍神經(jīng)鞘瘤和白血病在內(nèi)的多種惡性腫瘤中具有較好的效果。本課題擬在前期研究基礎(chǔ)上,通過細胞計數(shù)試劑盒、EdU、免疫蛋白印記、共聚焦顯微鏡、透射電鏡、彗星實驗、RNA干擾、裸鼠原位腫瘤種植等相關(guān)分子生物學技術(shù),分別從生物分子、細胞及動物模型水平研究探討三氟拉嗪對膠質(zhì)母細胞瘤細胞自噬及放療敏感性的作用及相關(guān)機制。第一部分三氟拉嗪抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞活性和增殖目的探究三氟拉嗪對膠質(zhì)母細胞瘤細胞活性及增殖的影響。方法1.利用細胞計數(shù)試劑盒(Cell-Counting-Kit-8,CCK-8)分別檢測不同濃度三氟拉嗪處理24小時及48小時后的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251、U87,原代膠質(zhì)母細胞瘤細胞P3及人正常膠質(zhì)細胞(Normal Human Astrocytes,NHA)的細胞活力。2.使用EdU染色檢測三氟拉嗪處理前后膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖。結(jié)果1.三氟拉嗪能夠降低膠質(zhì)母細胞瘤細胞活力CCK-8結(jié)果顯示三氟拉嗪在不同膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251、U87及原代細胞P3的半抑制濃度(IC50)分別為16 μM,15 μM,15.5 μM。與膠質(zhì)母細胞瘤細胞相比,人正常星形膠質(zhì)細胞對三氟拉嗪不敏感,其IC50為22.5μM(P0.05)。2.三氟拉嗪可顯著抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖EdU的結(jié)果顯示三氟拉嗪顯著抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251、U87的增殖(P0.05),并且是濃度依賴性的。結(jié)論1.三氟拉嗪能夠降低膠質(zhì)母細胞瘤的細胞活力。2.三氟拉嗪可抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖。第二部分 三氟拉嗪干擾膠質(zhì)母細胞瘤細胞的自噬流目的研究三 氟拉嗪對膠質(zhì)母細胞瘤細胞自噬流的影響。方法1.Western blot檢測不同濃度三氟拉嗪處理的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87中自噬相關(guān)基因LC3B的表達。2.用三氟拉嗪或者PBS(作為對照)處理提前轉(zhuǎn)染pSELECTGFP-LC3質(zhì)粒的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87。然后在共聚焦熒光顯微鏡下觀察不同處理組膠質(zhì)母細胞瘤細胞中GFP熒光斑點,并進行統(tǒng)計分析。3.透射電子顯微鏡下觀察并統(tǒng)計經(jīng)過三氟拉嗪或者PBS處理后的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87內(nèi)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體。4.Western blot檢測不同濃度三氟拉嗪及自噬抑制劑巴佛洛霉素、自噬誘導劑雷帕霉素處理后自噬相關(guān)基因P62在膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87中的蛋白水平。5.熒光顯微鏡下觀察巴佛洛霉素、三氟拉嗪及PBS處理后的膠質(zhì)母細胞瘤細胞U251和U87對溶酶體探針LysoTracker Red的親和力。結(jié)果1.三氟拉嗪增加LC3B-Ⅱ蛋白水平、GFP-LC3熒光斑點和自噬體的數(shù)量蛋白質(zhì)印記分析結(jié)果顯示,三氟拉嗪處理后膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87中自噬相關(guān)基因LC3B-Ⅱ的蛋白水平隨著三氟拉嗪濃度增加而遞增。激光共聚焦熒光顯微鏡觀察下我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過三氟拉嗪處理后的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87的GFP熒光斑點數(shù)目明顯增加。在透射電鏡下,我們發(fā)現(xiàn)用三氟拉嗪處理的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87中雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體數(shù)目顯著增加。2.三氟拉嗪增加P62蛋白水平,減少溶酶體熒光分子探針LysoTracker Red在細胞中的聚積由于自噬流阻滯后LC3B的蛋白水平也會增加,因此以上結(jié)果仍不能說明三氟拉嗪能夠促進或者抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的自噬水平。P62作為另外一種重要的自噬相關(guān)基因,在自噬流通暢的情況下被降解減少。而P62蛋白水平的升高往往預示著自噬流被阻斷。蛋白質(zhì)印記分析結(jié)果顯示,三氟拉嗪處理后的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87中P62蛋白水平增高。而且隨著三氟拉嗪濃度增加遞增。并借助自噬抑制劑巴佛洛霉素和自噬誘導劑雷帕霉素,我們發(fā)現(xiàn)同未經(jīng)藥物處理的細胞相比,P62蛋白水平在三氟拉嗪給藥組和巴佛洛霉素給藥組中都明顯升高,而雷帕霉素處理組中的P62蛋白水平降低。以前的基礎(chǔ)研究表明巴佛洛霉素可以通過降低溶酶體酸化的程度而阻斷自噬流末期。借助LysoTrackerRed,一種嗜酸性溶酶體探針,對巴佛洛霉素、三氟拉嗪處理后的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87進行染色,通過熒光顯微鏡我們發(fā)現(xiàn)三氟拉嗪和巴佛洛霉素一樣能夠明顯降低LysoTrackerRed在細胞中的聚積。結(jié)論三氟拉嗪通過阻礙溶酶體的酸化而抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的自噬流。第三部分三氟拉嗪增加膠質(zhì)母細胞瘤放療敏感性的作用及機制目的探討三氟拉嗪對膠質(zhì)母細胞瘤細胞放療敏感性的影響及潛在分子機制方法1.利用彗星實驗及蛋白質(zhì)印記分析檢測γ-H2AX蛋白水平,評估對照組、三氟拉嗪單獨處理組、單獨放療組和三氟拉嗪聯(lián)合放療組的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87中的DNA損傷情況。2.分別對單獨放療組和聯(lián)合治療組放療后2、6、12、24小時后的膠質(zhì)母細胞瘤細胞進行γ-H2AX免疫熒光染色,在激光共聚焦熒光顯微鏡下計數(shù)每組細胞核中γ-H2AX熒光斑點的數(shù)目。3.將不同濃度三氟拉嗪處理的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87提取蛋白后,利用免疫蛋白印記檢測DNA損傷修復相關(guān)基因Rad51、BRCA1、BRCA2的蛋白水平變化。4.利用同源重組檢測試劑盒檢測放射治療前后膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87的同源重組效率。5.將膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87分為四個治療組:對照組、三氟拉嗪處理組、放療組和三氟拉嗪聯(lián)合放療組,處理完成后對四組細胞進行克隆形成實驗,并利用Caspase 3/7活性測定試劑盒來檢測上述不同處理組細胞的凋亡。6.組織蛋白酶B、L活性檢測試劑盒檢測三氟拉嗪處理前后的組織蛋白酶B、L在膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87中的活性。7.蛋白質(zhì)印記分析檢測梯度濃度三氟拉嗪處理后膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87組織蛋白酶B和L的蛋白水平。8.使用siRNA特異性敲除膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87的組織蛋白酶L,然后利用蛋白質(zhì)印記分析檢測組織蛋白酶L、P62、Rad51和γ-H2AX的蛋白水平。9.利用同源重組試劑盒對比膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87敲除組織蛋白酶L前后的同源重組效率。10.構(gòu)建裸鼠膠質(zhì)母細胞瘤原位種植模型,分別設(shè)置PBS處理組、三氟拉嗪單獨給藥組、放療組、三氟拉嗪聯(lián)合放療組,計數(shù)各組裸鼠的存活時間,裸鼠取腦進行石蠟包埋切片后對顱內(nèi)腫瘤組織進行多種指標的免疫組化染色。結(jié)果1.三氟拉嗪增加放療導致的DNA損傷程度以前的研究發(fā)現(xiàn)通過基因敲除或者使用自噬抑制劑后可以降低腫瘤細胞對放療的抵抗性。為了探究三氟拉嗪是否能增加膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87的放療敏感性,我們利用彗星實驗檢測對照組、三氟拉嗪單獨處理組、單獨放療組和三氟拉嗪聯(lián)合放療組四組膠質(zhì)母細胞瘤細胞的DNA損傷程度。結(jié)果表明,在四個處理組中,三氟拉嗪聯(lián)合放療組的DNA損傷水平最高。蛋白質(zhì)印記分析檢測上述不同處理組γ-H2AX的蛋白水平也有相同的發(fā)現(xiàn)。2.三氟拉嗪減少DNA損傷修復蛋白印記分析表明,三氟拉嗪治療后能夠顯著減少膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87內(nèi)DNA同源性修復相關(guān)蛋白Rad51、BRCA1、BRCA2的蛋白水平,增加DNA雙鏈損傷標志物γ-H2AX的蛋白水平。同源重組效率檢測試劑盒結(jié)果顯示三氟拉嗪處理后的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87同源重組效率下降。3.三氟拉嗪聯(lián)合放療可抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖并增加細胞凋亡克隆形成實驗結(jié)果顯示同三氟拉嗪及放療單獨處理組相比,聯(lián)合治療組能夠明顯抑制細胞的增殖。并且Caspase 3/7活性檢測試劑盒結(jié)果顯示聯(lián)合治療組能夠明顯增加膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87的凋亡水平。4.三氟拉嗪降低膠質(zhì)母細胞瘤細胞內(nèi)組織蛋白酶活性三氟拉嗪處理后組織蛋白酶B、L在膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87中的活性顯著下降。免疫蛋白印記分析顯示三氟拉嗪還降低組織蛋白酶B和L的蛋白水平。5.組織蛋白酶L的沉默減少了 DNA損傷修復并抑制了自噬蛋白印記分析顯示沉默組織蛋白酶L后DNA損傷修復相關(guān)因子Rad51的表達水平下降。DNA雙鏈損傷標志物γ-H2AX的蛋白水平增加。同時自噬相關(guān)基因P62的蛋白水平增加。同源重組效率檢測試劑盒結(jié)果顯示敲除組織蛋白酶L后U251和U87細胞的同源重組效率下降。6.三氟拉嗪增加體內(nèi)膠質(zhì)母細胞瘤細胞的放療敏感性體內(nèi)實驗結(jié)果顯示同單獨放療及單獨三氟拉嗪處理組相比,聯(lián)合處理組能夠顯著增加荷瘤裸鼠的存活時間。免疫組化染色結(jié)果顯示聯(lián)合治療組能夠明顯抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖,增加DNA損傷及減少DNA損傷修復能力。結(jié)論1.三氟拉嗪在體內(nèi)外能夠明顯誘導膠質(zhì)母細胞瘤放療增敏。2.三氟拉嗪通過降低組織蛋白酶L水平抑制同源重組。
【圖文】：

ＴＦＰ邋（ｐＭ）邐ＴＦＰ邋（ｐＭ）逡逑圖１－２．三氟拉曝在體外抑制膠質(zhì)母細胞瘤的細胞活性。（Ａ）和（Ｂ）給予０，邋５和１０逡逑ｐＭ的三氟拉嗪處理后，ＥｄＵ檢測結(jié)果顯示三氟拉嗪能夠抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞逡逑增殖，并呈濃度梯度依賴性（＊Ｐ＜邋０．０５；邋＊＊Ｐ＜邋０．０１；標尺大小為５０邋ｐｍ）。逡逑２３逡逑

ＴＦＰ（ｍＭ）邐ＴＦＰ（ｉｊＭ）逡逑圖１－１．三氟拉嗪在體外抑制膠質(zhì)母細胞瘤的細胞活性。（Ａ）和（Ｂ）在給予不同逡逑濃度的三氟拉嗪處理２４小時和４８小時后，ＣＣＫ－８檢測膠質(zhì)母細胞瘤細胞系Ｕ２５１逡逑和Ｕ８７、原代膠質(zhì)母細胞瘤細胞Ｐ３和人星形細胞ＮＨＡ的細胞活性，結(jié)果顯示三氟逡逑拉嗪能夠降低膠質(zhì)母細胞瘤的細胞活性，并呈現(xiàn)濃度梯度依賴性。同膠質(zhì)母細胞逡逑瘤細胞相比，人星形細胞對三氟拉嗪的敏感性更低。逡逑ＥｄＵ邐Ｈｏｅｃｈｓｔ邐Ｍｅｒｇｅ邐ＥｄＵ邐Ｈｏｅｃｈｓｔ邐Ｍｅｒｇｅ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邐４＼邋＇邋＇邋＾邐．邋ｖ邋ｉ｝邐”１邋Ｎ邐！邋■ｗ＇．邋”逡逑ＴＦＰ邋（５ｍＭ＞邐丨卜、心Ｉ邐Ｌ邋：丨卜丨｜邋１；＇邐Ｊ逡逑ＴＦＰ邋（１０ＰＭ）邋■”二ｉ丨�。捱姡姡酰濉姟姡卞义希眨玻担边姡眨福峰义希洛义希眨玻担边姡眨福峰义希埃矗边姡窟姡蓿�0６ｌ逡逑Ｉ。：邋＿邐Ｉ－邐．逡逑ｉＭＭｍ邐＾：Ｂ邐￡ｍ逡逑０邐５邐１０邐０邐５邐１０逡逑ＴＦＰ邋（ｐＭ）邐ＴＦＰ邋（ｐＭ）逡逑圖１－２．三氟拉曝在體外抑制膠質(zhì)母細胞瘤的細胞活性。（Ａ）和（Ｂ）給予０，邋５和１０逡逑ｐＭ的三氟拉嗪處理后，ＥｄＵ檢測結(jié)果顯示三氟拉嗪能夠抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞逡逑增殖，并呈濃度梯度依賴性（＊Ｐ＜邋０．０５
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4

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本文編號：2671401