【摘要】：周圍神經(jīng)損傷作為當(dāng)前常見病,不同于其他組織損傷,其恢復(fù)過程較慢且常殘留部分癥狀,僅有不到一半的神經(jīng)損傷患者恢復(fù)了良好的感覺運(yùn)動功能。神經(jīng)損傷與修復(fù)是神經(jīng)學(xué)科與組織工程領(lǐng)域交叉學(xué)科共同研究的重點(diǎn),軸突定向再生是神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵,神經(jīng)導(dǎo)管在軸突的定向再生過程中起到了重要的作用。神經(jīng)組織工程學(xué)熱點(diǎn)材料PLGA因其組織相容性好、降解可控等優(yōu)點(diǎn)被廣泛使用,然而相較于自體神經(jīng)移植,其在神經(jīng)再生效率和功能恢復(fù)率上仍然較低。PLGA導(dǎo)管需要細(xì)胞粘附分子和神經(jīng)營養(yǎng)因子等為神經(jīng)再生提供更有利的微環(huán)境。IGF-1是一個(gè)含有70個(gè)氨基酸左右的單肽鏈,隸屬于胰島素家族,IGF-1對生長發(fā)育、神經(jīng)細(xì)胞的增殖分化、創(chuàng)傷修復(fù)以及結(jié)構(gòu)和功能整合具有重要的意義,在神經(jīng)系統(tǒng)其可促進(jìn)神經(jīng)生成、突觸形成、神經(jīng)保護(hù)、促進(jìn)增殖、抗凋亡等方面具有重要作用,同時(shí)其還有促進(jìn)軸突再生和再髓鞘化的功能;然而半衰期短、容易擴(kuò)散等缺點(diǎn)限制了其廣泛應(yīng)用。為了解決這些問題,我們將來源于膠原酶的膠原結(jié)合基團(tuán)(CBD)融合到人類IGF-1上,由于膠原廣泛存在,CBD可以增強(qiáng)藥物在受損區(qū)域滯留時(shí)間;同時(shí)將I型膠原交聯(lián)到PLGA導(dǎo)管上,作為細(xì)胞粘附分子增強(qiáng)導(dǎo)管的細(xì)胞粘附性,也為CBD-IGF-1提供靶向結(jié)合位點(diǎn)。目的將來源于膠原酶的膠原結(jié)合基團(tuán)(CBD)融合到人類IGF-1上,克服半衰期短、容易擴(kuò)散等缺點(diǎn),結(jié)合神經(jīng)組織工程學(xué)為周圍神經(jīng)損傷提供新的治療方式。方法將來自于膠原酶的膠原結(jié)合基團(tuán)的基因序列與人類胰島素樣生長因子1基因通過全基因合成方式融合,構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET-15b,然后轉(zhuǎn)染到大腸桿菌內(nèi)部進(jìn)行表達(dá),經(jīng)過分離、純化、復(fù)性,獲得改良的胰島素樣生長因子1,進(jìn)而行Western blot定性鑒定、膠原綁定能力測試、促進(jìn)細(xì)胞增殖能力測試、促進(jìn)細(xì)胞神經(jīng)向分化測試、促進(jìn)其它因子合成測試等細(xì)胞實(shí)驗(yàn);制作搭載膠原及CBD-IGF-1的復(fù)合PLGA導(dǎo)管,然后通過坐骨神經(jīng)缺損模型驗(yàn)證復(fù)合導(dǎo)管對神經(jīng)損傷修復(fù)的促進(jìn)作用結(jié)果運(yùn)用基因工程技術(shù)、原核表達(dá)系統(tǒng)成功獲得重組蛋白CBD-IGF-1,經(jīng)過SDS電泳及Western blot定性鑒定,確認(rèn)重組蛋白為CBD-IGF-1。膠原綁定能力測試結(jié)果顯示,CBD-IGF-1的膠原綁定能力明顯優(yōu)于IGF-1(p0.05),并且隨著濃度升高,這種膠原結(jié)合率更高;促細(xì)胞增殖能力測試,CBD-IGF-1能有效促進(jìn)施旺細(xì)胞和PC12細(xì)胞增殖,不同于IGF-1在較低濃度出現(xiàn)毒性濃度,其在1000ng/ml內(nèi)均能有效促進(jìn)細(xì)胞增殖;促進(jìn)PC12細(xì)胞神經(jīng)向分化方面CBD-IGF-1與IGF-1均能促進(jìn)細(xì)胞分化,且兩者在促分化能力方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);CBD-IGF-1能促進(jìn)施旺細(xì)胞表達(dá)IGF-1受體及NGF,抑制PC12細(xì)胞合成Nogo-A蛋白,與IGF-1相比其能力在干預(yù)初期不及IGF-1出現(xiàn)效果快,但是能穩(wěn)定持久保持刺激作用(p0.05)。成功制備PLGA導(dǎo)管,搭載膠原及CBD-IGF-1后表征分析提示,PLGA搭載膠原及CBD-IGF-1后接觸角明顯降低,親水性增強(qiáng)(p0.05);成功構(gòu)建大鼠坐骨神經(jīng)缺損5mm模型后,使用搭載膠原及CBD-IGF-1的PLGA導(dǎo)管橋接神經(jīng)斷端,術(shù)后步態(tài)分析結(jié)果、電生理學(xué)、坐骨神經(jīng)及腓腸肌組織病理學(xué)切片均提示PLGA搭載膠原及CBD-IGF-1能有效促進(jìn)神經(jīng)再生,同時(shí)與PLGA搭載膠原及IGF-1相比,CBD-IGF-1更能促進(jìn)神經(jīng)再生(p0.05)。結(jié)論1.通過基因重組和原核表達(dá)系統(tǒng)可以成功構(gòu)建并表達(dá)合成CBD-IGF-1。2.CBD-IGF-1具備較強(qiáng)的膠原綁定能力;能有效促進(jìn)施旺細(xì)胞和PC12細(xì)胞增殖;能促進(jìn)PC12細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化;能促進(jìn)施旺細(xì)胞合成IGF-1受體和NGF;能抑制PC12細(xì)胞表達(dá)Nogo-A蛋白。3.CBD-IGF-1在體內(nèi)具有良好的促進(jìn)神經(jīng)再生功能。4.PLGA導(dǎo)管搭載膠原及CBD-IGF-1是促進(jìn)神經(jīng)再生的有效組合。創(chuàng)新點(diǎn)1.通過基因工程將來源于膠原酶的膠原結(jié)合基團(tuán)(CBD)融合到人類IGF-1上,增強(qiáng)了IGF-1的膠原綁定能力和穩(wěn)定性,優(yōu)化了IGF-1的生物學(xué)性能。2.PLGA導(dǎo)管搭載膠原及CBD-IGF-1可作為良好的神經(jīng)組織工程學(xué)材料。
【圖文】：

32圖 2.1 pET-15b CBD-IGF-1 載體構(gòu)建圖紅色箭頭為目標(biāo)片段，黑色箭頭為限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。3）在融化的感受態(tài)細(xì)胞中加入 2ul 質(zhì)粒，輕輕晃動搖勻，在冰面放置 20 分鐘。4）在 42℃熱水浴中熱休克 45 秒，迅速將 EPP 管放置到冰面上 2 分鐘。5）再加入 950ul 已預(yù)熱到室溫的 LB 培養(yǎng)基，并放置于 37℃恒溫?fù)u床孵育 1.5小時(shí)（速度 150 rpm）。6）吸取 100ul 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，鋪板到含有 100ug/ml 氨芐青霉素的 LB 平板上，干

圖 2.2 CBD-IGF-1 分離純化蛋白液電泳染色：將凝膠浸泡在染色液中，搖床染色 4 小時(shí)。脫色：染色結(jié)束后將凝膠浸泡在脫色液中，置于搖床上脫色過夜，其間更換脫色液 3 次。拍片：用凝膠成像儀拍片。5）經(jīng)過電泳初步鑒定合成蛋白分子量在 5-10kD 之間，將蛋白液進(jìn)行下一步分離純化，利用 Ni-NTA 采用 PH 梯度洗脫，使用 dissolve buffer 調(diào)節(jié) PH 值依次為 6.5、5.5、4.5 進(jìn)行洗脫，每次洗脫液行電泳檢測。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R745

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Wei Wang;Jun Gao;Lei Na;Hongtao Jiang;Jingfeng Xue;Zhenjun Yang;Pei Wang;;Craniocerebral injury promotes the repair of peripheral nerve injury[J];Neural Regeneration Research;2014年18期

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本文編號：2649817