【摘要】：癲癇是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常的慢性疾病,具有反復(fù)發(fā)作的特征,可造成嚴(yán)重的家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)。在我國,癲癇的患病率約為3.6%-4.4%,尤其以16歲以下的兒童和青少年居多。雖然多種抗癲癇藥物相繼問世,但至今仍有30%左右的癲癇難以用藥物控制。因此,臨床需要一種更有效的治療癲癇的方法。生酮飲食在難治性癲癇中的治療作用已被廣泛接受。雖然其具體的作用機(jī)制至今未明,但大多數(shù)研究認(rèn)為β-羥丁酸是監(jiān)測生酮飲食抗癲癇效果的理想指標(biāo),也是生酮飲食發(fā)揮抗癲癇作用的主要物質(zhì)。故作為酮體最重要的組成部分,β-羥丁酸的神經(jīng)保護(hù)和抗癲癇作用成為研究的熱點(diǎn)。目前已有研究證明,外源性β-羥丁酸的應(yīng)用對(duì)部分癲癇模型和神經(jīng)系統(tǒng)其他疾病有神經(jīng)保護(hù)作用。β-羥丁酸可能會(huì)通過調(diào)節(jié)中樞系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)濃度,影響能量代謝和神經(jīng)元膜電位,抑制凋亡和氧化毒性損傷,減少鈣離子內(nèi)流等機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)和抗癲癇作用。鑒于生酮飲食臨床應(yīng)用的局限性,外源性β-羥丁酸制劑可能會(huì)替代生酮飲食成為治療難治性癲癇甚至其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新方向。本研究擬從以下三個(gè)部分研究外源性β-羥丁酸的抗癲癇作用。第一部分:外源性β-羥丁酸對(duì)體內(nèi)β-羥丁酸及血糖含量的影響目的:研究外源性β-羥丁酸(beta-hydroxybutyrate,BHB)對(duì)體內(nèi)BHB及血糖含量的影響。方法:1.32只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為A(n=9),B(n=9),C(n=9),D(n=5)四個(gè)組,分別腹腔注射2mmol/kg,4mmol/kg,8mmol/kg的D,L-β-羥丁酸及4ml/kg的生理鹽水。2.用乙醚麻醉大鼠,然后分別于注射BHB和生理鹽水的第0 min,15 min,45 min,75 min和90 min,通過內(nèi)眥靜脈采血,獲得約1mL血液。3.利用BHB檢測試劑盒檢測各個(gè)時(shí)間點(diǎn)大鼠血清中BHB的濃度。4.取20只Wistar大鼠,分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組10只。實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射4 mmol/kg的BHB,對(duì)照組大鼠腹腔注射4ml/kg的生理鹽水。5.分別于注射BHB和生理鹽水的第0min,15 min,45 min,75 min和90 min,從大鼠尾端末梢采集血液樣本,用羅氏血糖儀測定兩組大鼠的血糖濃度。6.利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果:1.外源性BHB能顯著增加大鼠血清中BHB的濃度。在沒有外源性BHB的作用下,血清中BHB的濃度約為0.57±0.01 mmol/L(各組間無顯著差異)。在不同濃度外源性BHB作用15 min之后,血清中BHB的濃度增加至1.35-2.37 mmol/L,并且在接下來的75 min內(nèi),BHB的濃度一直維持在這一水平。同時(shí),BHB作用組在所有時(shí)間點(diǎn)上的濃度要高于對(duì)照組。用2 mmol/kg,4 mmol/kg和8 mmol/kg BHB處理的各組之間,15 min時(shí)各組間無顯著差異,45 min、75 min、90min時(shí)各組間比較均有顯著差異。當(dāng)用4mmol/kgBHB作用時(shí),血清BHB的濃度相對(duì)穩(wěn)定,與大鼠在用生酮飲食處理后的水平非常相似。2.外源性BHB對(duì)大鼠血糖濃度無顯著影響。在注射4 mmol/kg BHB的15 min內(nèi),血糖濃度首先增加,然后在接下來的75 min之內(nèi),血糖濃度逐漸降低。然而,與對(duì)照組相比,血糖濃度的變化沒有顯著差異(p0.05)。此外,實(shí)驗(yàn)組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)之間的血糖濃度也沒有顯著差異(p0.05)。結(jié)論:1.外源性BHB能顯著增加大鼠血清中BHB的濃度。2.向大鼠腹腔注射4 mmol/kg的BHB,15 min即可使大鼠體內(nèi)BHB的濃度上升至與生酮飲食和饑餓時(shí)大鼠體內(nèi)BHB濃度相當(dāng)?shù)乃健?.腹腔注射BHB對(duì)大鼠血糖水平無顯著影響。第二部分:外源性β-羥丁酸對(duì)海人酸癲癇模型的保護(hù)作用目的:研究外源性BHB對(duì)海人酸誘導(dǎo)的癲癇模型的保護(hù)作用。方法:1.建立海人酸癲癇模型:用10 mg/kg的海人酸(kainic acid,KA)腹腔注射50只3周齡的雄性Wistar大鼠。注射KA 2 h后,根據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)動(dòng)物的癲癇發(fā)作行為進(jìn)行評(píng)價(jià):0級(jí),正常行為狀態(tài);Ⅰ級(jí),出現(xiàn)面部肌肉抽搐及濕狗樣顫動(dòng);Ⅱ級(jí),以點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)為主要表現(xiàn)的頸部肌肉抽搐;Ⅲ級(jí),前肢的陣攣、抽搐;Ⅳ級(jí),雙側(cè)前肢伸直,伴有身體的立起;V級(jí),跌倒和全身驚厥。Ⅲ級(jí)以下為復(fù)雜部分發(fā)作,Ⅳ和Ⅴ級(jí)為全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作。當(dāng)大鼠癲癇狀態(tài)持續(xù)超過90 min時(shí),給予10%的水合氯醛(400 mg/kg)以解除痙攣。2.將50只3周齡雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為BHB+KA組和NS+KA組,每組25只,其中NS+KA組為對(duì)照組。各組分別做如下處理:BHB+KA組腹腔注射4mmol/kg的BHB,30 min后再注射10mg/kg的海人酸;NS+KA組腹腔注射4ml/kg的生理鹽水,30 min后再注射10 mg/kg的海人酸。3.記錄每只大鼠出現(xiàn)Ⅳ級(jí)及以上發(fā)作行為的時(shí)間,并計(jì)算每只大鼠出現(xiàn)Ⅳ級(jí)及以上發(fā)作行為的潛伏期。4.在注射KA后的2h內(nèi),持續(xù)記錄第Ⅳ或Ⅴ級(jí)的癲癇的最高發(fā)作程度。5.利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果:1.BHB對(duì)大鼠KA癲癇發(fā)作潛伏期有顯著影響。通過對(duì)兩組大鼠體重的比較發(fā)現(xiàn),NS+KA組大鼠的平均體重(54.61±0.78 g)與BHB+KA組大鼠的平均體重(54.80±2.12 g)沒有顯著差異(p0.05)。進(jìn)一步對(duì)兩組大鼠出現(xiàn)Ⅳ級(jí)及以上癲癇發(fā)作行為的潛伏期進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NS+KA組大鼠癲癇發(fā)作的潛伏期(63.31±4.050min)顯著長于BHB+KA組大鼠癲癇發(fā)作的潛伏期(37.08±1.958min)(p0.05)。2.BHB對(duì)大鼠KA癲癇發(fā)作等級(jí)無顯著影響。腹腔注射4 mmol/kg BHB和4 ml/kg生理鹽水的兩組大鼠,30 min內(nèi)其行為均無任何異常表現(xiàn)。而在注射KA后兩組均出現(xiàn)癲癇發(fā)作行為,并且NS+KA組大鼠癲癇發(fā)作的最高等級(jí)(4.67±0.098)稍高于BHB+KA組大鼠癲癇發(fā)作的最高等級(jí)(4.54±0.100),但兩組間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:在KA誘導(dǎo)的大鼠癲癇模型中,BHB可以延長癲癇發(fā)作的潛伏期,但不能降低癲癇發(fā)作的等級(jí)。第三部分:外源性β-羥丁酸的抗癲癇作用目的:研究并探討外源性BHB的抗癲癇作用。方法:1.雄性Wistar大鼠分為BHB+KA,BHB,NS+KA和NS四個(gè)組,分別腹腔注射4 mmol/kg 的 BHB 和 10 mg/kg 的 KA,4 mmol/kg 的 BHB,4 ml/kg 的生理鹽水和10 mg/kg的KA,4 ml/kg的生理鹽水。2.在大鼠癲癇發(fā)作后第1、3、7和14天分批處死部分大鼠,取其腦組織,左側(cè)制備石蠟切片,右側(cè)剝離出海馬組織,立即放入-80℃冰箱冷凍。3.使用尼氏染色試劑盒對(duì)大鼠海馬組織石蠟切片進(jìn)行尼氏染色,觀察神經(jīng)元的缺失情況。4.使用Timm組織化學(xué)染色,觀察不同組中海馬組織的形態(tài)及苔蘚纖維發(fā)芽(MFS)情況。5.利用還原型谷胱甘肽(GSH)ELISA檢測試劑盒測定海馬組織中GSH的含量。6.利用Y-氨基丁酸(GABA)ELISA檢測試劑盒測定海馬組織中GABA的含量。7.利用三磷酸腺苷(ATP)ELISA檢測試劑盒測定海馬組織中ATP的含量。8.利用免疫熒光雙標(biāo)法觀察神經(jīng)特異性烯醇化酶(NSE)和膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)。9.用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果:1.BHB能緩解KA引起的神經(jīng)元損傷。在大鼠注射KA的第3天,通過尼氏染色法對(duì)大鼠海馬組織進(jìn)行染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在NS和BHB組的大鼠,其海馬體的海馬區(qū)并沒有發(fā)生神經(jīng)損傷。然而,KA組大鼠的CA1和CA3區(qū)域呈現(xiàn)典型的神經(jīng)元的缺失和損傷。與NS+KA組相比,BHB+KA組中神經(jīng)元的缺失有所減少。通過檢測大鼠海馬組織中GSH、GABA和ATP的含量,發(fā)現(xiàn)BHB+KA組中大鼠海馬組織的GSH和GABA的含量均有所回升,說明BHB對(duì)KA引起的大鼠海馬神經(jīng)元的損傷具有緩和作用。2.BHB能夠緩解KA癲癇模型的MFS出芽情況。在大鼠注射KA的第14天,通過Timm組織化學(xué)染色的方法對(duì)大鼠海馬進(jìn)行染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NS+KA組大鼠的平均Timm評(píng)分要顯著高于NS組、BHB組和 BHB+KA 組。而 NS 組(0.13±0.06)和 BHB 組(0.23±0.06)的 Timm 染色評(píng)分結(jié)果比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。BHB+KA組(1.5±0.50)的Timm染色平均評(píng)分要顯著低于NS+KA組(3.67±0.15)(p0.05)。表明在接受BHB預(yù)處理的KA癲癇模型中,MFS得到了緩解。3.BHB能減輕KA引起的神經(jīng)元損傷及星形膠質(zhì)細(xì)胞的代償性增生。在大鼠注射KA的第3和第7天,與NS組相比,NS+KA組中神經(jīng)元的數(shù)量有所減少,而星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量顯著增多。我們推測可能是KA引起神經(jīng)元的損傷,導(dǎo)致神經(jīng)元數(shù)量減少,星形膠質(zhì)細(xì)胞代償性增生。與NS+KA組相比,BHB+KA組神經(jīng)元數(shù)量有所增多,而星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量有所減少。說明BHB能減輕神經(jīng)元的損傷及星形膠質(zhì)細(xì)胞的代償性增生。結(jié)論:BHB能緩解KA引起的大鼠海馬神經(jīng)元的損傷。
【圖文】：

（二）外源性ＢＨＢ對(duì)大鼠血糖濃度的影響逡逑本研宄利用羅氏血糖儀對(duì)實(shí)驗(yàn)組（注射４邋ｍｍｏｌ／ｋｇ的ＢＨＢ）和對(duì)照組（注逡逑射４邋ｍｌ／ｋｇ的生理鹽水）中大鼠的血糖濃度進(jìn)行測定，結(jié)果如圖２所示。研宄發(fā)逡逑現(xiàn)，在注射４邋ｍｍｏｌ／ｋｇ邋ＢＨＢ的１５邋ｍｉｎ內(nèi)，血糖濃度首先上升，然后在接下來的逡逑７５邋ｍｉｎ之內(nèi)，血糖濃度逐漸下降。然而，與對(duì)照組相比，血糖濃度的變化沒有顯逡逑著差異（表２）。此外，研宄還發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)之間的血糖濃度也逡逑沒有顯著差異（表２），這也說明注射４邋ｍｍｏｌ／ｋｇ的ＢＨＢ對(duì)機(jī)體血糖濃度無影逡逑響。逡逑安邐－ｍ－邋ＢＨＢ邋４ｍｍｏｌ／ｋｇ逡逑＾邋７－邋ｔ邐＂邐－Ａ－邋ＮＳ４ｍｌ／ｋｇ逡逑旦邐Ｔ逡逑？邋６－逡逑一＂■二＾逡逑ｙ邋４－邐ｉ邐Ｔ逡逑ｏ逡逑３邐！邐Ｊ邐Ｊ邐Ｊ邐｜逡逑０邐２０邐４０邐６０邐８０邐１００逡逑Ｔｉｍｅ邋（ｍｉｎ）逡逑圖２．外源性ｐ＃丁酸對(duì)大鼠血糖的濃度無顯著影響逡逑ＢＨＢ，邋ｐ－羥丁酸。ＮＳ，生理鹽水。逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ邋ＢＨＢ邋ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ邋ｈａｄ邋ｎｏ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｎ邋ｂｌｏｏｄ邋ｇｌｕｃｏｓｅ邋ｌｅｖｅｌｓ．邋ＢＨＢ，逡逑ｐ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ，邋ＫＤ，邋ｋｅｔｏｇｅｎｉｃ邋ｄｉｅｔ；邋ＮＳ，邋ｎｏｒｍａｌ邋ｓａｌｉｎｅ．逡逑１９逡逑

逡逑結(jié)果如圖３所示。研究發(fā)現(xiàn)ＮＳ＋ＫＡ組大鼠癲癇發(fā)作的潛伏期為３７．０８±１．９５８邋ｍｉｎ，逡逑ＢＨＢ＋ＫＡ組大鼠癲癇發(fā)作的潛伏期為６３．３１±４．０５０邋ｍｉｎ，兩組大鼠癲癇發(fā)作的潛逡逑伏期差異顯著（＊ｐ＜０．０５）。逡逑＾邋８0１邋＊逡逑旦逡逑６０－逡逑■逡逑＾邋４０－逡逑ｌ0－邋ｎ邋■逡逑＾邋0］邐邐邐逡逑圖３．外源性ＢＨＢ延長了大鼠vr癇發(fā)作的潛伏期逡逑＊ｐ＜０．０５，與ＮＳ＋ＫＡ組相比。ＢＨＢ，卩－羥丁酸；ＫＡ，海人酸；ＮＳ，生理鹽水。逡逑Ｆｉｇ．３邋Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ邋ＢＨＢ邋ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ邋ｔｈｅ邋ｏｎｓｅｔ邋ｔｉｍｅ邋ｏｆ邋ｓｅｉｚｕｒｅ．邋＊ｐ＜邋０．０５，逡逑ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｔｈｅ邋ＮＳ＋ＫＡ邋ｇｒｏｕｐ．邋ＢＨＢ，邋Ｐ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ，邋ＫＡ，邋ｋａｉｎｉｃ邋ａｃｉｄ，邋ＮＳ，邋ｎｏｒｍａｌ逡逑ｓａｌｉｎｅ．逡逑（二）ＢＨＢ對(duì)大鼠vq癇發(fā)作等級(jí)的影響逡逑本研宄發(fā)現(xiàn)ＢＨＢ＋ＫＡ組和ＮＳ＋ＫＡ組大鼠在注射ＫＡ后均出現(xiàn)癲癇發(fā)作行逡逑為，，對(duì)ＢＨＢ＋ＫＡ組和ＮＳ＋ＫＡ組大鼠癲癇發(fā)作等級(jí)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ＮＳ＋ＫＡ逡逑組大鼠vR病發(fā)作的最尚等級(jí)為４．６７±０．０９８，稍聞?dòng)冢拢龋拢耍两M大鼠vR病發(fā)作的逡逑最局等級(jí)４．５４±０．１００，但兩組大鼠vR痛發(fā)作的最尚等級(jí)無顯著差異（圖４
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R742.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2647988