【摘要】：背景蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage,SAH)是指腦血管破裂后血液進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔的一種嚴(yán)重腦血管疾病。自發(fā)性SAH通常由顱內(nèi)動脈瘤破裂引起,死亡率及致殘率較高,給家庭和社會帶來巨大負(fù)擔(dān)。夾閉或栓塞動脈瘤防止再次出血,但SAH后腦損傷仍然繼續(xù),且目前尚無有效治療方法。茶葉中茶多酚的主要活性成分表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin Gallate,EGCG)是一種抗氧化劑,其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的保護(hù)作用已得到廣泛研究,但在SAH中的作用卻鮮有報道。目的從線粒體功能及自噬水平探討EGCG對SAH后神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法利用PC12細(xì)胞和氧合血紅蛋白(Oxyhemoglobin,OxyHb)建立體外SAH模型,濃度50μM的EGCG作為干預(yù)治療藥物,將實驗分組為Con組、SAH組和EGCG組,選取OxyHb作用后48h作為觀察點。1.利用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),MTT法檢測細(xì)胞活力,Western blot測定caspase3蛋白水平,觀察EGCG對SAH后細(xì)胞凋亡的的影響。2.使用JC-1試劑盒,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位(Mitochondrial Membrane Potential,?ψm)及線粒體形態(tài)變化,使用DCFH-DA試劑盒觀察細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的變化,用流式細(xì)胞術(shù)量化?ψm及ROS水平。利用Western blot檢測蛋白Drp1的表達(dá)。觀察EGCG對SAH后線粒體功能的保護(hù)作用。3.Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和Atg5,觀察EGCG對SAH后自噬的影響。4.利用差速離心法分離提取細(xì)胞內(nèi)線粒體,分別檢測細(xì)胞線粒體及非線粒體蛋白Bax、Cyt c水平,觀察EGCG是否通過內(nèi)部線粒體途徑發(fā)揮抗凋亡作用。結(jié)果1 EGCG抑制SAH后細(xì)胞異常增值和凋亡。正常PC12細(xì)胞有較長的樹突,且能相互交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),而OxyHb作用48h后,細(xì)胞表現(xiàn)出明顯皺縮和樹突減少。細(xì)胞活力測定顯示,與Con組相比,SAH組細(xì)胞活力明顯增加(P0.01),EGCG組較SAH組減弱(P0.05),EGCG組較Con組降低(P0.05)。caspase3蛋白水平結(jié)果顯示,SAH組較Con組明顯升高(P0.01),EGCG組較SAH組下降(P0.01)。2 EGCG能夠保護(hù)SAH后線粒體功能。2.1 EGCG抑制SAH后?ψm去極化。熒光顯微鏡觀察可見,Con組細(xì)胞內(nèi)紅色與綠色熒光處于基礎(chǔ)水平,而SAH組紅色熒光減少,綠色熒光增加,EGCG組紅色與綠色熒光又恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。流式細(xì)胞術(shù)量化顯示,與Con組相比,SAH組細(xì)胞內(nèi)?ψm降低(P0.01),EGCG組細(xì)胞內(nèi)?ψm較SAH組升高(P0.01)。2.2 EGCG降低SAH后細(xì)胞內(nèi)ROS水平。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),Con組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光較弱,SAH組綠色熒光增加,EGCG組綠色熒光較SAH組減弱。流式細(xì)胞術(shù)量化顯示,與Con組相比,SAH組細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高(P0.01),EGCG組細(xì)胞內(nèi)ROS水平較SAH組降低(P0.05)。2.3 EGCG保護(hù)SAH后細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),Con組細(xì)胞中較長的棒狀線粒體占多數(shù),并交織成網(wǎng),SAH組部分線粒體碎裂,長的棒狀線粒體減少,而EGCG組中線粒體形態(tài)趨于正常。Drp1蛋白水平測定顯示,與Con組相比,SAH組表達(dá)量上升(P0.05),EGCG組表達(dá)量較SAH組降低(P0.05)。3 EGCG調(diào)節(jié)SAH后異常自噬。Beclin-1蛋白表達(dá)水平顯示,與Con組相比,SAH組表達(dá)升高(P0.01),EGCG組較SAH組降低(P0.05),表明EGCG抑制了SAH后自噬的啟動。與Con組相比,SAH后Atg5蛋白表達(dá)降低(P0.01),EGCG組Atg5蛋白表達(dá)較SAH組升高(P0.05),表明EGCG可能促進(jìn)自噬體延續(xù)。4 EGCG調(diào)節(jié)SAH后凋亡線粒體途徑相關(guān)蛋白水平。4.1細(xì)胞線粒體中凋亡線粒體途徑相關(guān)蛋白水平。SAH組Bax蛋白水平較Con組升高(P0.05),Cyt c蛋白水平較Con組明顯下降(P0.01);與SAH組相比,EGCG組線粒體中Bax蛋白水平下降(P0.05),Cyt c蛋白水平升高(P0.05)。4.2細(xì)胞胞漿中凋亡線粒體途徑相關(guān)蛋白水平。SAH組Bax蛋白水平較Con組降低(P0.01),Cyt c蛋白水平較Con組升高(P0.05);與SAH組相比,EGCG組Bax蛋白水平升高(P0.05),Cyt c蛋白水平降低(P0.01)。結(jié)論SAH后EGCG通過抑制異常自噬流和改善線粒體功能,進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡而發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。
【圖文】：

樹突減少，提示 OxyHb 可能影響細(xì)胞的功能。Con 組 SAH 組圖 1 顯微鏡下觀察 PC12 細(xì)胞（×200）檢測細(xì)胞活力結(jié)果如圖 2，與 Con 組（0.40 ± 0.15）相比，，細(xì)胞活力顯著升高（0.64± 0.25，P < 0.01 vs Con組），EGCG組（ SAH 組降低（P < 0.05 vs SAH 組）。提示 EGCG 抑制 SAH 后

結(jié)果1 EGCG 抑制 SAH 后神經(jīng)細(xì)胞異常增值和凋亡。倒置顯微鏡觀察PC12細(xì)胞的表面形態(tài)（圖1），可以看出正常組細(xì)胞能形成樹突，且能相互交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而用 OxyHb 刺激 PC12 細(xì)胞建立 SAH 模型后，細(xì)胞表現(xiàn)出明顯皺縮，樹突減少，提示 OxyHb 可能影響細(xì)胞的功能。Con 組 SAH 組圖 1 顯微鏡下觀察 PC12 細(xì)胞（×200）MTT 法檢測細(xì)胞活力結(jié)果如圖 2，與 Con 組（0.40 ± 0.15）相比，OxyHb 刺激48h后PC12細(xì)胞活力顯著升高（0.64± 0.25，P < 0.01 vs Con組）
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R743.35

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