【摘要】：缺血性腦卒中是一個動態(tài)發(fā)展的過程。盡快恢復(fù)缺血區(qū)血液灌注是減輕腦損傷以及功能障礙最有效的方法。但是,由于缺血性腦卒中的突發(fā)性以及溶栓治療的時間依賴性,臨床上只有少數(shù)患者能夠在時間窗內(nèi)接受溶栓治療,這嚴重影響腦卒中的治療和預(yù)后。大腦是對缺血損傷最敏感的組織,海馬腦區(qū)由于與學(xué)習、記憶和情緒密切相關(guān),而備受關(guān)注。研究表明,大鼠在短暫性缺血再灌注(transient ischemic-reperfusion,I/R)后,海馬神經(jīng)元呈現(xiàn)不同的病理改變。缺血損傷會誘導(dǎo)CA1區(qū)出現(xiàn)遲發(fā)性錐體神經(jīng)元死亡,而CA3區(qū)和DG區(qū)神經(jīng)元則不受其影響,而且機制未明。大腦作為機體內(nèi)最重要器官,具有多種自我保護機制,如抗氧化、抗興奮毒性、抗凋亡和增強促存活基因的表達等。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)作為神經(jīng)營養(yǎng)素家族的一員,參與神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元分化、神經(jīng)元存活和突觸可塑性等調(diào)節(jié)過程,并且與缺血腦損傷密切相關(guān)。但是,腦缺血后海馬BDNF表達變化的機制仍不明確。本研究首先采用Puslinelli四血管夾閉法成功建立大鼠短暫性前腦缺血再灌注模型,通過與正常組和sham組相比評估缺血再灌注后海馬各腦區(qū)BDNF蛋白以及mRNA表達的改變,并探討其可能機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),短暫性前腦缺血48h后,成年大鼠海馬CA1區(qū)中BDNF蛋白表達降低,CA3和DG區(qū)的BDNF蛋白表達增加。缺血刺激可抑制海馬腦區(qū)BDNF轉(zhuǎn)錄本IV在CA1中的表達,但增加了轉(zhuǎn)錄本I、IIc、III、IV、VI和X1在CA3和DG中的表達。然后通過ChIP研究發(fā)現(xiàn),在BDNF的啟動子1,2,4和6中,缺血導(dǎo)致CA1區(qū)H3K27ac水平降低,H3K9ac和H3K14ac水平升高;CA3區(qū)H3K9ac,H3K14ac和H3K27ac水平升高;DG區(qū)組蛋白乙酰化水平無明顯變化。上述實驗結(jié)果表明,BDNF基因啟動子區(qū)組蛋白的乙�；Ｊ�,可能通過改變BDNF不同轉(zhuǎn)錄本的表達發(fā)揮調(diào)控海馬腦區(qū)BDNF蛋白表達的作用,這將會為缺血性腦損傷的治療提供新途徑。第一部分短暫性前腦缺血再灌注對BDNF蛋白以及mRNA表達的影響目的:通過建立短暫性前腦缺血再灌注模型,與正常組和假手術(shù)組比較,觀察BDNF蛋白及mRNA表達的變化。方法:1.實驗分組:正常對照組(naive組),假手術(shù)組(sham組)和短暫性前腦缺血再灌注組(I/R組)。2.短暫性前腦缺血再灌注模型的制備:I/R組:雄性SD大鼠(240-260g),經(jīng)戊巴比妥鈉(5mg/100g,i.p.)麻醉后,經(jīng)耳固定于立體定位儀上。電凝雙側(cè)椎動脈并分離雙側(cè)頸總動脈后,于術(shù)后第二日夾閉雙側(cè)頸總動脈15min后恢復(fù)灌注,造成短暫前腦缺血。sham組:除不電凝椎動脈,不夾閉頸總動脈之外,其余操作同I/R組。3.用Western Blot和RT-qPCR法檢測不同分組海馬各區(qū)的BDNF蛋白和mRNA相對表達水平。結(jié)果:1.Western Blot結(jié)果顯示:與正常組相比較,sham組大鼠海馬各分區(qū)BDNF相對表達量無統(tǒng)計學(xué)差異。與sham組相比,I/R組大鼠CA1區(qū)BDNF蛋白表達水平顯著降低,CA3區(qū)和DG區(qū)BDNF蛋白水平在缺血后顯著升高。2.RT-qPCR結(jié)果顯示:與正常組相比較,sham組大鼠海馬各分區(qū)BDNF mRNA相對表達量無統(tǒng)計學(xué)差異。與sham組相比,缺血再灌注后CA3區(qū)和DG區(qū)BDNF轉(zhuǎn)錄本I、IIc、III、IV、VI和X1表達均上調(diào)。缺血再灌注后CA1區(qū)BDNF轉(zhuǎn)錄本I、III、VI和X1表達上調(diào),BDNF轉(zhuǎn)錄本IV下調(diào),BDNF轉(zhuǎn)錄本IIc表達無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:短暫性前腦缺血再灌注后,海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元BDNF蛋白表達降,BDNF轉(zhuǎn)錄本IV表達降低;CA3區(qū)和DG區(qū)在缺血后BDNF蛋白表達升高,BDNF轉(zhuǎn)錄本I、IIc、III、IV、VI和X1表達升高。第二部分短暫性前腦缺血再灌注對BDNF啟動子區(qū)域乙�；降挠绊懩康�:組蛋白的不同修飾可以導(dǎo)致染色質(zhì)重塑,從而調(diào)控基因表達。組蛋白乙�；梢允沟媒M蛋白和DNA間的相互作用減弱,導(dǎo)致染色質(zhì)構(gòu)象松散,這樣的狀態(tài)有助于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子接近并結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子,進而促進基因轉(zhuǎn)錄。研究表明,組蛋白的乙�；⒓谆头核鼗刃揎�,可以調(diào)控BDNF蛋白表達,并與許多神經(jīng)系統(tǒng)的疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此我們推測,組蛋白乙�；揎椏赡茉谌毖俟嘧⒑驜DNF基因表達變化中發(fā)揮調(diào)控作用。本實驗通過建立大鼠短暫性前腦缺血再灌注模型,與sham組比較,觀察BDNF啟動子區(qū)組蛋白H3K9ac,H3K14ac和H3K27ac水平的變化。方法:1.實驗分組:sham組,I/R組。2.采用Ch IP方法檢測sham組和I/R組大鼠海馬CA1,CA3和DG區(qū)的BDNF啟動子1,2,4和6上的H3K9,H3K14和H3K27乙�；降淖兓＝Y(jié)果:與sham組相比,I/R組BDNF基因啟動子1,2,4,6區(qū)的H3K27ac的水平在CA1區(qū)降低,在CA3區(qū)升高。H3K9ac和H3K14ac水平在CA1區(qū)和CA3區(qū)均升高。在DG區(qū),BDNF基因多個啟動子區(qū)的H3K9ac,H3K14ac和H3K27ac的水平無顯著變化。結(jié)論:短暫性前腦缺血再灌注后,CA1區(qū)BDNF基因啟動子區(qū)組蛋白低H3K27ac程度可能通過抑制BDNF轉(zhuǎn)錄本IV轉(zhuǎn)錄,降低BDNF蛋白表達;CA3區(qū)BDNF基因啟動子區(qū)高H3K9ac,H3K14ac和H3K27ac程度可能通過促進BDNF轉(zhuǎn)錄本I、IIc、III、IV、VI和X1轉(zhuǎn)錄,升高BDNF蛋白表達;DG區(qū)BDNF蛋白表達與啟動子區(qū)H3K9ac,H3K14ac和H3K27ac程度無顯著關(guān)系。
【圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文2 結(jié) 果 短暫性前腦缺血再灌注后大鼠海馬腦區(qū) BDNF 蛋白表達發(fā)生Western Blot 檢測結(jié)果顯示：與正常組大鼠相比，sham 組大鼠 CA1，CA3DNF 蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)差異。和 sham 組相比，I/R 組大鼠 CA1 區(qū) BDNF 平顯著降低（P<0.001，，n=8），而 CA3 區(qū)（P<0.05，n=8）和 DG 區(qū)（P<表達水平升高，有統(tǒng)計學(xué)差異（圖 1）。

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文2.2 短暫性前腦缺血再灌注對大鼠海馬腦區(qū) BDNFmRNA 表達的影響RT-qPCR 結(jié)果顯示：與正常組相比，sham 組大鼠海馬 BDNF mRNA 表達量無變化。與 sham 組相比，缺血再灌注組大鼠海馬 CA3 和 DG 區(qū) BDNF mRNA I、IIc、III、IV、VI 和 X1 表達均上調(diào)，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01 或 P<0.001，n=6）。缺血再灌注后CA1區(qū)BDNF mRNA I、III、VI和X1表達上調(diào)（P<0.05，P<0.01或P<0.001，n=6），BDNF mRNA IV 下調(diào)（P<0.05，n=6）。BDNF mRNA IIc 表達無統(tǒng)計學(xué)意義（圖 2）。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R743.31

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本文編號：2645430