發(fā)布時(shí)間：2020-04-23 22:09

【摘要】：目的:該項(xiàng)研究主要應(yīng)用高通量的Solexa測序方法篩選出人腦卒中后認(rèn)知功能障礙組(Post-stroke Cognitive Impairment,PSCI)、腦卒中后認(rèn)知功能正常組(Post-stroke Cognitive Normality,PSCN)、年齡匹配對照組(Age-matched Controls,AMC)3組間顯著差異表達(dá)的血清microRNAs(miRNAs),并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)通過蒙特利爾認(rèn)知評估量表(Montreal Cognitive Assessment,MoCA)對以上人群進(jìn)行認(rèn)知功能評定,以探討這顯著差異表達(dá)的miRNAs與腦卒中后認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性,從而判斷其是否可為卒中后認(rèn)知障礙早期診斷、早期干預(yù)的客觀依據(jù)。方法:本研究招募了 PSCI組、PSCN組以及AMC組各40例,三組間年齡、性別、受教育年限、基礎(chǔ)疾病相匹配,另外PSCI組、PSCN組間卒中類型、病灶、病程、腦卒中損傷程度相匹配。第一階段:分別從PSCI組、PSCN組以及AMC組血清標(biāo)本中,各選取5例血清標(biāo)本,三組間年齡、性別、受教育年限、基礎(chǔ)疾病相匹配,另外PSCI組、PSCN組間卒中類型、病灶、病程、腦卒中損傷程度相匹配。進(jìn)行高通量的Solexa測序,初步篩選出PSCI組、PSCN組、AMC組間顯著差異表達(dá)miRNAs。第二階段:根據(jù)高通量的Solexa測序結(jié)果進(jìn)行大規(guī)模、二階段精確的定量驗(yàn)證,采用qRT-PCR檢測三組血清中初篩選出的顯著差異表達(dá)的miRNAs,并使用2-△Ct法計(jì)算其相對表達(dá)水平。為了探討篩選的顯著差異表達(dá)的miRNAs與腦卒中后認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性,本研究采用了 Spearman相關(guān)分析對血清中顯著差異表達(dá)的miRNAs相對表達(dá)水平與MoCA評分進(jìn)行了相關(guān)性分析。為了檢驗(yàn)差異表達(dá)的miRNAs對腦卒中后認(rèn)知功能障礙的預(yù)測價(jià)值,本研究進(jìn)一步采用了 ROC(receiver operating characteristic,ROC)曲線及曲線下面積(areaundercurve,AUC)進(jìn)行分析。結(jié)果:通過高通量的Solexa測序技術(shù)篩選及qRT-PCR驗(yàn)證過程,我們得到6個(gè)PSCI組與 PSCN 組、AMC 組間顯著差異表達(dá)的血清 miRNAs:hsa-miR-191-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-93-5p、miR-5991-y。其中 hsa-miR-191-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-93-5p、miR-5991-y 在 PSCI 患者血清中呈顯著上調(diào)狀態(tài)(P0.05),hsa-miR-193b-5p在PSCI患者血清中呈顯著下調(diào)狀態(tài)(P0.05)。本研究運(yùn)用Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)MoCA評分與血清hsa-miR-191-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-20b-5p、miR-5991-y、hsa-miR-93-5p 的相對表達(dá)量間存在較強(qiáng)正相關(guān)(P0.05),與血清hsa-miR-193b-5p的相對表達(dá)量間存在較強(qiáng)負(fù)相關(guān)(P0.05)。進(jìn)一步構(gòu)建ROC曲線并得到 AUC(95%CI),結(jié)果如下:hsa-miR-193b-5p、miR-5991-y、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-191-5p 的 AUC 分別為 0.905、0.817、0.751、0.741、0.650、0.642(P0.01)。靈敏度、特異度分別為 hsa-miR-193b-5p(100%、85.7%)、miR-5991-y(77.5%、80.0%)、hsa-miR-20a-5p(63.2%、66.7%)、hsa-miR-93-5p(64.1%、62.2%)、hsa-miR-20b-5p(65.0%、57.0%)、hsa-miR-191-5p(58.5%、60.5%)。結(jié)論:1、通過高通量的Solexa測序技術(shù)的篩選及qRT-PCR驗(yàn)證過程,得到6個(gè)顯著差異表達(dá)的血清miRNAs,其中hsa-miR-191-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-93-5p、miR-5991-y在PSCI患者血清中呈顯著上調(diào)狀態(tài),has-miR-193b-5p在PSCI患者血清中呈顯著下調(diào)狀態(tài)。2、血清 hsa-miR-191-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-20b-5p、miR-5991-y、hsa-miR-93-5p表達(dá)水平越高,hsa-miR-193b-5p表達(dá)水平越低,提示腦卒中后發(fā)生認(rèn)知功能障礙的可能性越大。3、血清miRNAs檢測操作簡單方便,而且無創(chuàng),作為卒中后認(rèn)知功能障礙早期診斷與預(yù)后的生物標(biāo)志物具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【圖文】：

Ａ熒光定量ＰＣＲ檢測試劑盒（型號：ＭＲ１０１－０２）邐南京諾唯贊生物科技有限公司逡逑、無水乙醇邐國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司逡逑引物邐上海鉑尚生物技術(shù)有限公司逡逑ｓｅ－Ｆｒｅｅ邋ｗａｔｅｒ邐南京諾唯贊生物科技有限公司逡逑０邋１＾１、１－２００邋ｐｉ、１００－１０００邋吸嘴（ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ）邐美國邋Ｋｉｒｇｅｎ邋公司逡逑ｌ微量離心管（ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ）邐美國Ｋｉｒｇｅｎ公司逡逑］邋ＰＣＲ邋管（ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ）邐美國邋Ｋｉｒｇｅｎ邋公司逡逑ｌ八聯(lián)排管（ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ）邐美國Ｋｉｒｇｅｎ公司逡逑實(shí)驗(yàn)方法逡逑邋Ｓｏｌｅｘａ高通量測序逡逑別從ＰＳＣＩ組、ＰＳＣＮ組以及ＡＭＣ組血清標(biāo)本中，各選�。祩�(gè)血清標(biāo)本，三組逡逑、性別、受教育年限、基礎(chǔ)疾病相匹配，另外ＰＳＣＩ組、ＰＳＣＮ組間腦卒中類型、逡逑位、病程、腦卒中損傷程度相匹配。將標(biāo)本埋于干冰送往廣州市基迪奧生物有限逡逑行高通量的Ｓｏｌｅｘａ測序，，具體步驟見圖１－１、圖１－２。逡逑

間年齡、性別、受教育年限、基礎(chǔ)疾病相匹配，另外ＰＳＣＩ組、ＰＳＣＮ組間腦卒中類型、逡逑發(fā)病部位、病程、腦卒中損傷程度相匹配。將標(biāo)本埋于干冰送往廣州市基迪奧生物有限逡逑公司進(jìn)行高通量的Ｓｏｌｅｘａ測序，具體步驟見圖１－１、圖１－２。逡逑Ｓｍａｌｌ邋ＲＮＡ邐Ｌｅｎｇｔｈ逡逑５，邋Ｐｆ－ｒ邋？攀■ｉＴ－ｒ邋＿邋Ｉ邋Ｉ邋■－ｒｒｒＴ邋Ｔｉ－ｒｏＨ邐１０－３０邋ｎｔ逡逑３＇邋ａｄａｐｔｏｒ邋ｌｉｂａｔｉｏｎ逡逑５．邋Ｐ邋＿邋＿邋邐邐＾邋３＇ａａａｐ，ｃ＂邋３６－５０邋ｎｔ逡逑５＇－ａｄａｐｔｏｒ邋ｌｉｇａｔｉｏｎ邋Ｉ邐１４－ｋｍａｉ－ｊ？此逡逑ｆｌＴｆｎ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｍ邋ｌ邋ｌ邋ｌ邋ｌ邋Ｉ邋邐邐邐邐Ｐ＇邐６２－７５邋ｎｔ逡逑Ｔ４－ＲＮＡ邐ｊ逡逑＾＞￣邐＾邐３邐３．l挘洌洌穡簦錚蟈義希蟈澹翦危忮邋五五五澹殄澹殄澹翦澹礤澹潁蟈五義希懾危遙藻澹穡潁椋恚澹蟈義希懾澹遙澹觶澹潁螅邋澹簦潁幔睿螅悖潁椋穡簦椋錚鑠義希悖模危鈴澹翦義希停灣澹懾澹懾澹懾濉鰣澹灣澹懾濉鰣澹懾濉鰣澹懾濉鰣澹懾澹懾澹懾濉鰣澹懾澹懾澹懾澹殄義希擔(dān)擼媯洌幔穡

本文編號：2638202