【摘要】：背景:膠質(zhì)瘤發(fā)病率大約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的70%,嚴(yán)重影響了患者的生存期,盡管患膠質(zhì)瘤病人接受了手術(shù)、放療、化療等綜合治療,由于腫瘤的異質(zhì)性及其高代謝對(duì)凋亡的抗性導(dǎo)致患者預(yù)后較差,因此探索通過(guò)調(diào)控膠質(zhì)瘤代謝誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤發(fā)生非凋亡方式死亡具有重要的臨床意義。同時(shí)研究顯示,腫瘤的一個(gè)重要特點(diǎn)就是脂類物質(zhì)過(guò)多合成及利用,脂類物質(zhì)對(duì)腫瘤進(jìn)行生物合成及細(xì)胞增殖具有重要作用;膠質(zhì)瘤脂肪酸合成酶明顯增加,與膠質(zhì)瘤WHO分級(jí)呈正相關(guān),抑制膠質(zhì)瘤脂肪酸合成能有效抑制膠質(zhì)瘤增殖。探索抑制膠質(zhì)瘤脂肪酸合成藥物成為治療膠質(zhì)瘤的有效手段。脹亡是一種非經(jīng)典的死亡方式,主要表現(xiàn)為細(xì)胞漿內(nèi)大量空泡,細(xì)胞膜出泡及細(xì)胞核溶解,與細(xì)胞內(nèi)ATP快速下降及線粒體損傷具有密切相關(guān)性,其形態(tài)學(xué)特征不同于細(xì)胞凋亡,脹亡作為一種殺死癌細(xì)胞的新策略正在被積極探索。文獻(xiàn)報(bào)道天然化合物如青蒿素、澳洲茄邊堿及合成抗生素銅硫甲酰素能夠有效通過(guò)脹亡這種死亡方式誘導(dǎo)腫瘤死亡。小檗堿是從中藥黃連中分離的一種季銨生物堿,在中國(guó)被用于治療腸道感染數(shù)百年,同時(shí)發(fā)現(xiàn)小檗堿具有抗腫瘤作用。另外發(fā)現(xiàn)小檗堿具有調(diào)控血糖、血脂作用,而糖、脂類等物質(zhì)在線粒體中進(jìn)行氧化高效提供ATP對(duì)膠質(zhì)瘤的生存發(fā)揮巨大作用。目前為止,小檗堿是否能誘發(fā)膠質(zhì)瘤發(fā)生脹亡及降低膠質(zhì)瘤脂肪酸合成尚不明確,因此我們分別應(yīng)用膠質(zhì)瘤細(xì)胞及膠質(zhì)瘤細(xì)胞體內(nèi)成瘤內(nèi)模型探索小檗堿對(duì)膠質(zhì)瘤的抑制作用。目的:本研究的目的是探索小檗堿誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤死亡方式及其對(duì)膠質(zhì)瘤脂肪酸合成的影響,進(jìn)一步探索其作用分子機(jī)制。方法:MTT檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞存活率的影響、相差顯微鏡及透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化、流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞死亡形式、自噬雙標(biāo)腺病毒(Ad-m CherryGFP-LC3B)感染標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞自噬、線粒體染色觀察線粒體形態(tài)學(xué)變化、seahorse檢測(cè)細(xì)胞線粒體耗氧量及糖酵解及細(xì)胞代謝狀態(tài)等代謝改變,western blot及免疫組化檢測(cè)相關(guān)蛋白變化細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)觀察小檗堿對(duì)膠質(zhì)瘤增殖的影響,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察膠質(zhì)瘤遷移及侵襲,質(zhì)譜法及磷脂染色法檢測(cè)細(xì)胞脂類變化,western blot及免疫組化檢測(cè)PI3K/AKT/SREBP1/FASN信號(hào)通路蛋白變化。結(jié)果:1.MTT顯示小檗堿顯著降低細(xì)胞存活率,呈時(shí)間依賴性及濃度依賴性,膠質(zhì)瘤細(xì)胞呈脹亡樣死亡,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡,細(xì)胞膜出泡,流氏細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞死亡細(xì)胞PI+,seahorse檢測(cè)細(xì)胞OCR減少,轉(zhuǎn)向糖酵解產(chǎn)ATP,ATP產(chǎn)量急劇下降,細(xì)胞及線粒體ERK蛋白活性下降。2.小檗堿導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)ROS升高,GSH及NADPH顯著下降(P0.05),具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,應(yīng)用NAC清除ROS不能有效提高膠質(zhì)瘤生存率(P0.05),也不能提高膠質(zhì)瘤ATP生成。3.小檗堿抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆形成具有濃度依賴性,顯著抑制膠質(zhì)瘤侵襲及遷移能力(P0.05),同時(shí)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸,磷脂顯著下降,磷酸化PI3K和磷酸化AKT蛋白顯著下調(diào),SREBP1活性成分及FASN表達(dá)下調(diào)。結(jié)論:1.小檗堿通過(guò)抑制線粒體ERK蛋白抑制線粒體有氧呼吸供能,使細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)能下降,出現(xiàn)ATP快速耗竭,導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞以脹亡方式死亡。2.小檗堿導(dǎo)致膠質(zhì)瘤抗氧化能力下降。3.小檗堿通過(guò)下調(diào)PI3K/AKT/SREBP1/FASN下調(diào)膠質(zhì)瘤脂肪酸合成,從而抑制膠質(zhì)瘤增殖,遷移及侵襲能力。
【圖文】：

標(biāo)志[5]。實(shí)驗(yàn)證明，在膠質(zhì)瘤中其顯著特征也是代謝重組，其不僅通過(guò)糖酵解進(jìn)行底物供應(yīng)，，同時(shí)進(jìn)行葡萄糖氧化、脂肪酸氧化等多種手段維持膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)[2, 6-9]。線粒體是腫瘤物質(zhì)代謝的至關(guān)重要器官之一，其在能量供應(yīng)，腫瘤底物如脂肪酸、氨基酸、核酸代謝中發(fā)揮重要作用[10-12]，如圖 1.1。

系列生物化學(xué)反應(yīng)，最終經(jīng)過(guò)脂肪酸合成關(guān)鍵酶-脂肪酸合成酶（fatty acidnthase, FASN ）作用形成棕櫚酸酯，進(jìn)一步經(jīng)過(guò)硬脂酰輔酶 A 脫氫酶stearoyl-CoAdesaturase，SCD）形成單不飽和脂肪酸，形成不同形式脂肪酸進(jìn)存儲(chǔ)，脂肪酸也可經(jīng)過(guò)膽固醇轉(zhuǎn)化獲得[30]（圖 1.2）。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.4

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本文編號(hào)：2636388