【摘要】：研究背景:腦卒中是最常見的死亡方式之一,并且具有較高的致死率、致殘率和較多并發(fā)癥,嚴重的威脅著全球人類的健康。腦卒中給健康和經(jīng)濟帶來巨大的影響,極大的消耗醫(yī)療資源。其中缺血性腦卒中占整體腦卒中60%以上,缺血性腦卒中是由血栓、栓塞或系統(tǒng)性低灌注造成的,這些因素可以導致局部腦血流量受限,最終造成支持細胞穩(wěn)態(tài)的氧、糖供應(yīng)不足。同時,再灌注可造成二次腦組織損傷及其他并發(fā)癥,在腦缺血損傷中也發(fā)揮重要作用。腦缺血再灌注損傷可誘發(fā)多因素、多機制和有害的級聯(lián)反應(yīng),包括能量代謝障礙、氧化應(yīng)激、興奮毒性、鈣超載、血腦屏障損傷、炎癥、細胞凋亡基因激活等。除上述之外,最近的研究表明自噬也是參與腦缺血再灌注損傷的重要機制。自噬不僅是一種防御機制可清除細胞質(zhì)中的受損細胞器和代謝產(chǎn)物,也會激活細胞死亡程序誘導細胞死亡。這些機制間相互加強,相互聯(lián)系,相互重疊,形成惡性循環(huán),最終可導致神經(jīng)元死亡。目前缺血性腦卒中的治療措施包括急性溶栓、血管再通及搭橋等方法,但急性期后的治療效果仍然有限。因此,必須尋找新的治療靶點,提高患者預后。在我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥方面,中藥由于其作用緩和、副作用少并且具有多重保護作用而被廣泛應(yīng)用于臨床治療,并取得了較好的臨床效果。枸杞是一種非常重要的傳統(tǒng)中藥材,具有多種生物活性和藥理作用。枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide,LBP)是枸杞的主要活性成分。之前的一些研究證實LBP具有調(diào)節(jié)免疫,抗腫瘤,抗衰老和抗氧化等作用。此外,近幾年已有研究表明LBP可減輕神經(jīng)元損傷,發(fā)揮神經(jīng)保護作用,但LBP發(fā)揮神經(jīng)保護作用的具體機制目前尚不清楚。PI3K/Akt/m TOR(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin)信號通路是控制細胞增殖、生長、代謝和存活的關(guān)鍵,依賴于多種機制。這條信號通路對腦缺血的神經(jīng)保護作用目前已被廣泛研究。之前的研究表明,激活PI3K/Akt/m TOR信號通路可下調(diào)自噬;并且這條通路能夠抑制凋亡和自噬,促進細胞周期。因此,PI3K/Akt/m TOR信號通路與凋亡和自噬具有高度的相關(guān)性�；谝陨系难芯勘尘�,本研究旨在探討LBP對神經(jīng)元的保護作用,及LBP通過調(diào)控PI3K/Akt/m TOR信號通路對凋亡和自噬的影響。研究目的:本研究建立了原代海馬神經(jīng)元OGD/R(oxygen glucose deprivation and reoxygenation)損傷模型擬觀察和探究:(1)LBP對神經(jīng)元的保護作用;(2)LBP對神經(jīng)元凋亡的作用;(3)LBP對神經(jīng)元自噬的作用;(4)LBP通過調(diào)控PI3K/Akt/m TOR信號通路對凋亡和自噬的影響。研究方法:1、成熟后的原代海馬神經(jīng)元氧糖剝奪條件下培養(yǎng)3小時,正常條件下復氧24小時,建立離體腦缺血再灌注損傷模型;2、處理后的神經(jīng)元被隨機分為5組,正常對照組(Control)、氧糖剝奪再灌注損傷組(OGD/R)、LBP低、中、高劑量(15,30,60μg/ml)處理組。LBP于氧糖剝奪后,再灌注之前加入;3、海馬神經(jīng)元存活率的評估通過檢測MTT;海馬神經(jīng)元損傷的評估通過檢測LDH的釋放量;4、采用DCFH-DA熒光探針檢測神經(jīng)元中ROS水平;通過TBA比色法測定MDA水平;5、采用TUNEL熒光染色法評價神經(jīng)元細胞凋亡水平;6、采用免疫熒光染色法測定cleaved-Caspase3、LC3及Beclin 1的表達水平;7、采用透射電鏡觀察自噬小體和自噬溶酶體的形態(tài)及數(shù)量;8、采用免疫印記法檢測cleaved-Caspase3,Caspase3,Bax,Bcl-2,LC3-II,LC3-I,Beclin 1,p62,p-m TOR,m TOR,p-Akt,Akt蛋白表達。研究結(jié)果:第一部分:與Control組相比,OGD/R組顯著降低神經(jīng)元存活率,并且增加了LDH的釋放率;與OGD/R組相比,LBP(15,30,60μg/ml)處理組顯著降低LDH的釋放率,且增加神經(jīng)元的存活率。與此同時,OGD/R組誘導ROS和MDA水平升高,與Control組相比;LBP(15,30,60μg/ml)處理組可降低OGD/R損傷誘的ROS和MDA水平。第二部分:與Control組相比,TUNEL陽性凋亡細胞數(shù)量在OGD/R組中增加;LBP(15,30,60μg/ml)處理組中可觀察到TUNEL陽性凋亡細胞數(shù)較OGD/R組減少。此外,本研究還檢測了凋亡相關(guān)蛋白的表達,與Control組相比,OGD/R組中cleaved-Caspase3/Caspase3比值增加,Bcl-2/Bax比值降低;與OGD/R組相比,LBP(15,30,60μg/ml)處理組中cleaved-Caspase3/Caspase3比值降低,Bcl-2/Bax比值增加。并且免疫熒光檢測cleaved-Caspase3表達與Western Blot法結(jié)果相似。第三部分:在OGD/R損傷后,Beclin 1蛋白表達水平和LC3II/LC3I比值增加,p62蛋白表達水平降低,與Control組相比;LBP(15,30,60μg/ml)處理組可降低Beclin 1蛋白表達水平和LC3-II/LC3-I比值,增加p62蛋白表達水平。同時,免疫熒光檢測LC3和Beclin 1表達與Western Blot法結(jié)果相似。電鏡觀察OGD/R組中自噬小體和自噬溶酶體數(shù)量較正常對照組顯著增多;LBP 60μg/ml處理組中自噬小體和自噬溶酶體數(shù)量較OGD/R組減少。第四部分:在OGD/R損傷后,p-Akt和p-m TOR蛋白表達水平降低,與Control組相比;然而,LBP(15,30,60μg/ml)處理組上調(diào)p-Akt和p-m TOR表達水平。為了進一步探究LBP與PI3K/Akt/m TOR信號通路的關(guān)系,本研究采用了PI3K特異性抑制劑LY294002,結(jié)果顯示LBP 60μg/ml處理組可上調(diào)p-Akt和p-m TOR表達水平,下調(diào)cleaved-Caspase3、LC3-II表達水平,減輕神經(jīng)元損傷,發(fā)揮神經(jīng)保護作用。研究結(jié)論:1、LBP可減輕海馬神經(jīng)元OGD/R損傷,具有神經(jīng)保護作用;2、LBP可減輕OGD/R損傷誘導的海馬神經(jīng)元細胞凋亡;3、LBP可抑制OGD/R損傷誘導的海馬神經(jīng)元自噬性細胞死亡;4、LBP可激活PI3K/Akt/m TOR信號通路抑制OGD/R損傷誘導的神經(jīng)元凋亡和自噬性細胞死亡,發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
【圖文】：

由于腦組織對氧含量和能量供應(yīng)的變化十分敏感，以及神經(jīng)元細胞為不可再生的細胞特性，因此，一旦缺血、缺氧損傷造成神經(jīng)元死亡，，由此所造成的神經(jīng)功能損傷將難以恢復。腦缺血再灌注損傷是指缺血區(qū)域在恢復血液灌注后出現(xiàn)腦組織損傷加重和神經(jīng)功能障礙的現(xiàn)象。在腦缺血再灌注損傷中，血流量低灌注核心區(qū)域的神經(jīng)元細胞死亡是無力扭轉(zhuǎn)的，但在其周圍半暗帶存在的大量瀕死狀態(tài)神經(jīng)元內(nèi)部血流灌注量也明顯低于正常值，及時、有效的給予適當?shù)闹委煼椒軌蚪档图毎l(fā)生凋亡和壞死，提高細胞存活率。Abtrup 在 1977 年首次將此部分描述為缺血半暗帶（Ischem ic penum-bra，IP），使人們有了新的認識，開辟了腦缺血再灌注損傷治療的新大陸，改善缺血半暗帶內(nèi)神經(jīng)元細胞的存活及功能狀態(tài)成為了治療腦缺血再灌注損傷的重要靶點[19, 20]。近年來，隨著基礎(chǔ)研究與醫(yī)學技術(shù)的長足發(fā)展，關(guān)于腦缺血再灌注損傷的病理機制也被進一步研究，例如能量代謝障礙、自由基與氧化應(yīng)激損傷、鈣離子超載、興奮性氨基酸毒性、炎癥反應(yīng)、血腦屏障損壞、細胞凋亡等，這些機制發(fā)生于不同時間點，互為因果、相互重疊、相互聯(lián)系（圖 1）。

圖 2：腦缺血損傷后細胞內(nèi)氧化/氮化應(yīng)激形成機制（引自 Chamorro á，et al. Lancet Neurol. 2016 Jul;15（8）:869活性氧自由基與氧化應(yīng)激損傷自由基在腦缺血再灌注損傷中通過多種途徑生成，引發(fā)氧化基的生成導致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及核酸發(fā)生過氧化，正常膜結(jié)構(gòu)進一步造成線粒體變性、裂解，神經(jīng)元發(fā)生不可逆改變，最由基導致興奮性氨基酸釋放增加，重攝取受阻，造成神經(jīng)毒損傷，尤其在再灌注時期，自由基的產(chǎn)生與內(nèi)源性抗氧化系形成惡性循環(huán)；④內(nèi)皮細胞損傷導致血-腦屏障受損，通透性微循環(huán)受阻；⑤花生四烯酸代謝失常，向血栓烷 A2 轉(zhuǎn)化增多攣、血小板聚集，導致梗死面積增加，加重損傷；⑥細胞因，介導免疫和炎癥反應(yīng)，導致?lián)p傷加重；⑦促使大分子物質(zhì)如 D糖等交聯(lián)增加，導致原本的生物學活性降低[24]。
【學位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R743

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前7條

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本文編號：2633880