【摘要】：背景腦出血(Intracranial hemorrhage,ICH)是一種具有高患病率和高致死率的疾病。腦出血后往往伴有顯著的腦水腫以及高顱壓,引起嚴重的神經功能損傷。然而,由于目前對ICH后神經功能損傷發(fā)生的潛在機制仍不清楚,靶向治療或開發(fā)有效藥物來治療ICH仍然是一個挑戰(zhàn)。在人類,ICH癥狀出現后3小時內血腫周圍會發(fā)生水腫,10-20天后水腫達到高峰。腦水腫會導致顱內壓升高,中線結構移位,是發(fā)生神經功能損傷的關鍵因素。ICH后的水腫類型是多樣的,但主要形式是由血腦屏障(Blood-brain barrier,BBB)破壞引起的血管源性腦水腫。米諾環(huán)素(Minocycline,Mino)是第二代半合成四環(huán)素衍生物,具有抗微生物和抑制小膠質細胞激活的作用。在過去的二十年中,Mino作為神經保護劑已被廣泛應用于臨床實踐中。由于其高親脂性和易穿透組織的特性,Mino可以很容易穿透BBB。盡管有許多研究關注這種化學物質的生理特性和作用,但Mino在ICH后維持BBB的完整性和滲透性并減輕腦水腫的潛在分子機制目前尚不清楚。證據顯示Wnt/β-catenin信號通路通過調控多個下游分子的表達來減輕腦水腫和改善ICH的癥狀。相反,抑制Wnt/β-catenin通路的激活可加重腦水腫和ICH癥狀。同時,Wnt/β-catenin通路的抑制可增加炎癥介質的產生,進而導致ICH預后不良。Dickkopf-1(DKK1)是Wnt/β-catenin通路的上游抑制劑,抑制DKK1的表達可增強Wnt信號通路活性,增加β-catenin的表達。雖然Mino對ICH的腦保護作用,以及它對包括PI3K,MAPK和NF-κB在內的多種信號通路的影響已被廣泛報道,但仍有較多未知,例如Mino是否通過作用于DKK1,繼而影響Wnt信號通路介導的抗炎反應來發(fā)揮神經保護作用尚未見報道。目的在本研究中,我們使用膠原酶誘導的大鼠ICH模型以及體外培養(yǎng)的大鼠小膠質細胞評估Mino對Wnt/β-catenin通路,炎癥反應,BBB結構和神經功能的影響,并闡明潛在的分子機制。方法(1)建立膠原酶誘導的大鼠ICH模型,在不同時間點測量腦組織伊文思藍的外滲和腦含水量來評估BBB的完整性。(2)Mino溶解于鹽水中,在建立ICH模型時和12小時后分別以45mg/kg的劑量腹腔內注射,然后每天兩次(每次22.5mg/kg)給藥,持續(xù)2天;siDKK1在ICH模型制作前48小時通過側腦室注射的方法注入腦室。(3)應用western blot,比較不同組別中(Sham;ICH+vehicle;ICH+siNC;ICH+siDKK1;ICH+Mino;ICH+siDKK1+Mino)DKK1,Wnt1,β-catenin,Occludin蛋白的表達變化。(4)將數量為4.0×10~5的大鼠小膠質細胞置于12孔板中,用大腸桿菌LPS(不同濃度)處理24小時,然后通過ELISA測定無細胞上清液的細胞因子和MMP-9水平。用大腸桿菌LPS處理4小時后收集全細胞裂解物,通過western blot測定Wnt通路蛋白及Occludin蛋白表達水平。(5)為了進一步研究DKK1的功能,我們采用CD11b/c,NeuN和GFAP等分子標記,通過免疫熒光法檢測DKK1在血腫周圍組織中的細胞定位。(6)采用神經功能缺損評分和神經功能測試(包括前肢放置、前肢使用不對稱試驗和轉角試驗)來評價神經功能狀況。結果(1)與sham組相比,ICH組出血側基底節(jié)區(qū)伊文思藍的滲出量明顯增加。與第1天和第7天比較,伊文思藍外滲在ICH后第3天最顯著(P0.001)。此外,腦含水量在ICH后第1天和第3天基底節(jié)區(qū)也顯著增加,但在第7天沒有明顯增加。和第1天和第7天比較,第3天腦含水量最高(P0.01)。(2)與vehicle組相比,Mino組出血側基底節(jié)區(qū)伊文思藍外滲在第3天明顯減少(P0.05)。同時,Mino治療組出血側基底節(jié)區(qū)腦含水量與vehicle組比較,也有顯著減少(P0.01)。(3)與vehicle組相比,Mino治療組血腫周圍組織中DKK1的表達顯著降低(P0.01)。此外,免疫組化顯示ICH后血腫周圍組織中DKK1的表達顯著增加,而Mino治療后可抑制ICH引起的DKK1增加,western blot的結果也和其一致。通過采用包括CD11b/c,NeuN和GFAP在內的多種分子標記的免疫熒光來檢測DKK1在血腫周圍組織中的定位,結果發(fā)現DKK1與CD11b/c、NeuN陽性細胞共定位,但不與GFAP陽性細胞共定位。隨后我們研究了Mino對大鼠小膠質細胞中DKK1表達和炎癥介質產生的影響。與vehicle組相比,Mino強烈地降低DKK1的表達,同時顯著增加β-catenin的表達。為進一步研究Mino的抗炎作用,使用大腸桿菌LPS(TLR4的經典激動劑)分別在有和無Mino的情況下處理小神經膠質細胞,結果顯示Mino預處理顯著降低了LPS誘導的TNF,IL-6和MMP-9的產生。(4)與vehicle組相比,Mino治療組顯著增加了血腫周圍腦組織中Wnt1,β-catenin,Occludin蛋白的表達(Wnt1:P0.01;β-catenin:P0.01;Occludin:P0.05),表明Mino可激活Wnt1及其下游分子(β-catenin,Occludin蛋白)。與ICH組相比,使用siDKK1抑制DKK1可使Wnt1,β-catenin和Occludin的表達明顯增加(Wnt1:P0.01;β-catenin:P0.01;Occludin:P0.05)。此外,siDKK1抑制DKK1同時使用Mino處理可發(fā)揮協(xié)同作用,與任一單因素處理組相比差異均有統(tǒng)計學意義(Wnt1:P0.05;β-catenin:P0.05;Occludin:P0.01)。我們還評估了Mino和siRNA介導的DKK1缺乏對BBB完整性和通透性的影響,發(fā)現與vehicle組相比,Mino治療后伊文思藍滲出量和腦含水量明顯降低(P0.05),且Mino+siDKK1組較單一處理組相比這種減弱作用更顯著(P0.05)。ICH后第3天的神經功能缺損檢查顯示,Mino或siDKK1治療均可明顯減輕神經功能缺損,包括神經功能評分、轉角試驗、前肢放置和前肢使用不協(xié)調評分(P0.05),表明Mino和siDKK1具有神經保護作用,而Mino+siDKK1治療組與單Mino組或單siDKK1組比較差異無顯著性(P0.05)。結論Mino通過抑制血腫周圍組織(小膠質細胞為主)中DKK1表達,導致Wnt/β-catenin信號通路激活,炎癥反應抑制,從而減輕BBB破壞,最終改善ICH后的神經功能損傷。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R743.34

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