【摘要】：背景腦出血(Intracranial hemorrhage,ICH)是一種具有高患病率和高致死率的疾病。腦出血后往往伴有顯著的腦水腫以及高顱壓,引起嚴(yán)重的神經(jīng)功能損傷。然而,由于目前對(duì)ICH后神經(jīng)功能損傷發(fā)生的潛在機(jī)制仍不清楚,靶向治療或開(kāi)發(fā)有效藥物來(lái)治療ICH仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。在人類,ICH癥狀出現(xiàn)后3小時(shí)內(nèi)血腫周圍會(huì)發(fā)生水腫,10-20天后水腫達(dá)到高峰。腦水腫會(huì)導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高,中線結(jié)構(gòu)移位,是發(fā)生神經(jīng)功能損傷的關(guān)鍵因素。ICH后的水腫類型是多樣的,但主要形式是由血腦屏障(Blood-brain barrier,BBB)破壞引起的血管源性腦水腫。米諾環(huán)素(Minocycline,Mino)是第二代半合成四環(huán)素衍生物,具有抗微生物和抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活的作用。在過(guò)去的二十年中,Mino作為神經(jīng)保護(hù)劑已被廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐中。由于其高親脂性和易穿透組織的特性,Mino可以很容易穿透BBB。盡管有許多研究關(guān)注這種化學(xué)物質(zhì)的生理特性和作用,但Mino在ICH后維持BBB的完整性和滲透性并減輕腦水腫的潛在分子機(jī)制目前尚不清楚。證據(jù)顯示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控多個(gè)下游分子的表達(dá)來(lái)減輕腦水腫和改善ICH的癥狀。相反,抑制Wnt/β-catenin通路的激活可加重腦水腫和ICH癥狀。同時(shí),Wnt/β-catenin通路的抑制可增加炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,進(jìn)而導(dǎo)致ICH預(yù)后不良。Dickkopf-1(DKK1)是Wnt/β-catenin通路的上游抑制劑,抑制DKK1的表達(dá)可增強(qiáng)Wnt信號(hào)通路活性,增加β-catenin的表達(dá)。雖然Mino對(duì)ICH的腦保護(hù)作用,以及它對(duì)包括PI3K,MAPK和NF-κB在內(nèi)的多種信號(hào)通路的影響已被廣泛報(bào)道,但仍有較多未知,例如Mino是否通過(guò)作用于DKK1,繼而影響Wnt信號(hào)通路介導(dǎo)的抗炎反應(yīng)來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。目的在本研究中,我們使用膠原酶誘導(dǎo)的大鼠ICH模型以及體外培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞評(píng)估Mino對(duì)Wnt/β-catenin通路,炎癥反應(yīng),BBB結(jié)構(gòu)和神經(jīng)功能的影響,并闡明潛在的分子機(jī)制。方法(1)建立膠原酶誘導(dǎo)的大鼠ICH模型,在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量腦組織伊文思藍(lán)的外滲和腦含水量來(lái)評(píng)估BBB的完整性。(2)Mino溶解于鹽水中,在建立ICH模型時(shí)和12小時(shí)后分別以45mg/kg的劑量腹腔內(nèi)注射,然后每天兩次(每次22.5mg/kg)給藥,持續(xù)2天;siDKK1在ICH模型制作前48小時(shí)通過(guò)側(cè)腦室注射的方法注入腦室。(3)應(yīng)用western blot,比較不同組別中(Sham;ICH+vehicle;ICH+siNC;ICH+siDKK1;ICH+Mino;ICH+siDKK1+Mino)DKK1,Wnt1,β-catenin,Occludin蛋白的表達(dá)變化。(4)將數(shù)量為4.0×10~5的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞置于12孔板中,用大腸桿菌LPS(不同濃度)處理24小時(shí),然后通過(guò)ELISA測(cè)定無(wú)細(xì)胞上清液的細(xì)胞因子和MMP-9水平。用大腸桿菌LPS處理4小時(shí)后收集全細(xì)胞裂解物,通過(guò)western blot測(cè)定Wnt通路蛋白及Occludin蛋白表達(dá)水平。(5)為了進(jìn)一步研究DKK1的功能,我們采用CD11b/c,NeuN和GFAP等分子標(biāo)記,通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)DKK1在血腫周圍組織中的細(xì)胞定位。(6)采用神經(jīng)功能缺損評(píng)分和神經(jīng)功能測(cè)試(包括前肢放置、前肢使用不對(duì)稱試驗(yàn)和轉(zhuǎn)角試驗(yàn))來(lái)評(píng)價(jià)神經(jīng)功能狀況。結(jié)果(1)與sham組相比,ICH組出血側(cè)基底節(jié)區(qū)伊文思藍(lán)的滲出量明顯增加。與第1天和第7天比較,伊文思藍(lán)外滲在ICH后第3天最顯著(P0.001)。此外,腦含水量在ICH后第1天和第3天基底節(jié)區(qū)也顯著增加,但在第7天沒(méi)有明顯增加。和第1天和第7天比較,第3天腦含水量最高(P0.01)。(2)與vehicle組相比,Mino組出血側(cè)基底節(jié)區(qū)伊文思藍(lán)外滲在第3天明顯減少(P0.05)。同時(shí),Mino治療組出血側(cè)基底節(jié)區(qū)腦含水量與vehicle組比較,也有顯著減少(P0.01)。(3)與vehicle組相比,Mino治療組血腫周圍組織中DKK1的表達(dá)顯著降低(P0.01)。此外,免疫組化顯示ICH后血腫周圍組織中DKK1的表達(dá)顯著增加,而Mino治療后可抑制ICH引起的DKK1增加,western blot的結(jié)果也和其一致。通過(guò)采用包括CD11b/c,NeuN和GFAP在內(nèi)的多種分子標(biāo)記的免疫熒光來(lái)檢測(cè)DKK1在血腫周圍組織中的定位,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DKK1與CD11b/c、NeuN陽(yáng)性細(xì)胞共定位,但不與GFAP陽(yáng)性細(xì)胞共定位。隨后我們研究了Mino對(duì)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中DKK1表達(dá)和炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的影響。與vehicle組相比,Mino強(qiáng)烈地降低DKK1的表達(dá),同時(shí)顯著增加β-catenin的表達(dá)。為進(jìn)一步研究Mino的抗炎作用,使用大腸桿菌LPS(TLR4的經(jīng)典激動(dòng)劑)分別在有和無(wú)Mino的情況下處理小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,結(jié)果顯示Mino預(yù)處理顯著降低了LPS誘導(dǎo)的TNF,IL-6和MMP-9的產(chǎn)生。(4)與vehicle組相比,Mino治療組顯著增加了血腫周圍腦組織中Wnt1,β-catenin,Occludin蛋白的表達(dá)(Wnt1:P0.01;β-catenin:P0.01;Occludin:P0.05),表明Mino可激活Wnt1及其下游分子(β-catenin,Occludin蛋白)。與ICH組相比,使用siDKK1抑制DKK1可使Wnt1,β-catenin和Occludin的表達(dá)明顯增加(Wnt1:P0.01;β-catenin:P0.01;Occludin:P0.05)。此外,siDKK1抑制DKK1同時(shí)使用Mino處理可發(fā)揮協(xié)同作用,與任一單因素處理組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Wnt1:P0.05;β-catenin:P0.05;Occludin:P0.01)。我們還評(píng)估了Mino和siRNA介導(dǎo)的DKK1缺乏對(duì)BBB完整性和通透性的影響,發(fā)現(xiàn)與vehicle組相比,Mino治療后伊文思藍(lán)滲出量和腦含水量明顯降低(P0.05),且Mino+siDKK1組較單一處理組相比這種減弱作用更顯著(P0.05)。ICH后第3天的神經(jīng)功能缺損檢查顯示,Mino或siDKK1治療均可明顯減輕神經(jīng)功能缺損,包括神經(jīng)功能評(píng)分、轉(zhuǎn)角試驗(yàn)、前肢放置和前肢使用不協(xié)調(diào)評(píng)分(P0.05),表明Mino和siDKK1具有神經(jīng)保護(hù)作用,而Mino+siDKK1治療組與單Mino組或單siDKK1組比較差異無(wú)顯著性(P0.05)。結(jié)論Mino通過(guò)抑制血腫周圍組織(小膠質(zhì)細(xì)胞為主)中DKK1表達(dá),導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活,炎癥反應(yīng)抑制,從而減輕BBB破壞,最終改善ICH后的神經(jīng)功能損傷。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R743.34

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本文編號(hào)：2632947