【摘要】：惡性腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤作為最難以治療的腫瘤類型之一,由于生長(zhǎng)位置的限制使得手術(shù)切割不徹底、容易壓迫神經(jīng)、損害正常人體功能等,目前對(duì)其仍無(wú)有效的臨床治療方案。用于膠質(zhì)瘤治療的藥物多種多樣,核酸類藥物如小干擾RNA(siRNA)作為近幾年的研究熱點(diǎn),在腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療中占有一席之地。特別是近年來(lái)納米技術(shù)的飛速發(fā)展,極大提高了siRNA的遞送效率,加速了siRNA藥物的臨床轉(zhuǎn)化。但諸多遞送屏障如血液穩(wěn)定性、血腦屏障(BBB)、腫瘤主動(dòng)富集及原位有效釋放等仍是目前亟需解決的科學(xué)難題�；诖�,本課題構(gòu)建了一種三重作用力(電荷、氫鍵、疏水)穩(wěn)定的siRNA納米藥物(3I-NM@siRNA),通過(guò)腦靶向配體Angiopep-2(Ang)的修飾,其具有膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療的潛質(zhì)。凝膠電泳實(shí)驗(yàn)和動(dòng)態(tài)激光光散射結(jié)果表明,相對(duì)于傳統(tǒng)的單重作用力(電荷)穩(wěn)定的siRNA納米藥物(1I-NM@siRNA),3I-NM@siRNA具有更好的siRNA包裹能力和壓縮能力,形成較小的納米顆粒(38納米)。生理穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,3I-NM@siRNA在負(fù)電荷物質(zhì)肝素鈉的競(jìng)爭(zhēng)下具有更好的穩(wěn)定性,其血液循環(huán)時(shí)間(半衰期38分鐘)相對(duì)于1I-NM@siRNA(半衰期8分鐘)也有較大程度的提高。同時(shí),由于本實(shí)驗(yàn)采用的疏水穩(wěn)定分子具有活性氧(ROS)響應(yīng)性能,使得3I-NM@siRNA在模擬腫瘤微環(huán)境的條件下,能夠快速有效的釋放出裝載的siRNA藥物,從而發(fā)揮其治療效果。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,通過(guò)Angiopep-2多肽配體的修飾,3I-NM@siRNA對(duì)于人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG具有很好的靶向能力。流式定量分析得到Ang-3I-NM@siRNA靶向效率是非靶向納米粒子的3.5倍。同時(shí),熒光素酶RNA干擾細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了其靶向性,Ang-3I-NM@siRNA的基因沉默效率到達(dá)80%,遠(yuǎn)高于同樣條件下的非靶向納米粒子3I-NM@siRNA(50%)。另外,MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Ang-3I-NM@siRNA納米顆�；緹o(wú)毒,具有良好的生物相容性。為驗(yàn)證Ang-3I-NM@siRNA的治療效果,本論文針對(duì)Polo樣激酶-1(PLK1)為靶點(diǎn)進(jìn)行了進(jìn)一步的RNA干擾實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示,在siRNA濃度為200 nM的條件下,Ang-3I-NM@siRNA的基因沉默效率在mRNA和蛋白水平分別達(dá)到80%和63%,展現(xiàn)出良好的siRNA治療效果。為進(jìn)一步驗(yàn)證Ang-3I-NM@siRNA的靶向和治療效果,本論文構(gòu)建了原位人神經(jīng)膠質(zhì)瘤小鼠模型。siRNA納米藥物的體內(nèi)生物分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Ang-3I-NM@siRNA具有更好的神經(jīng)膠質(zhì)瘤靶向能力,在腫瘤部位的積累量是3I-NM@siRNA的二倍。選用siPLK1和siVEGFR2(VEGFR2:血管內(nèi)皮增長(zhǎng)因子受體)兩種siRNA對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤小鼠進(jìn)行治療實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,Ang-3I-NM@si(PLK1+VEGFR2)組小鼠的腫瘤增長(zhǎng)最緩慢、體重變化最少且小鼠生存周期最長(zhǎng)(52天)。腫瘤的組織學(xué)HE染色和TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Ang-3I-NM@si(PLK1+VEGFR2)組具有最好的腫瘤細(xì)胞增殖抑制和殺傷效果。采用CD31(血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子)標(biāo)記血管,通過(guò)免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Ang-3I-NM@siVEGFR2和Ang-3I-NM@si(PLK1+VEGFR2)組腫瘤中新生血管的數(shù)量相較于其它組明顯減少。通過(guò)以上治療結(jié)果可知,siPLK1和siVEGFR2具有協(xié)同治療腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤的效果。綜上所述,本論文成功構(gòu)建了一種三重作用力穩(wěn)定的腦靶向siRNA納米藥物,其具有較好的血液穩(wěn)定性、較高的腦腫瘤富集能力以及有效的腫瘤原位siRNA釋放。細(xì)胞和動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)證實(shí)了攜帶治療性siRNA的納米藥物具有很好的基因沉默和腫瘤生長(zhǎng)抑制效果。此智能型siRNA納米藥物具有人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床治療的潛力。
【圖文】：

圖 1-1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤中被破壞的關(guān)鍵細(xì)胞通路的簡(jiǎn)圖概述（縮寫(xiě):RTK -受體酪氨酸激酶、PTEN -磷酸酶和緊張素同源物、PI3K -磷酸肌醇激酶、VEGFR -血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體、雷帕霉素 mTOR -哺乳動(dòng)物靶蛋白、MAPK -絲裂原活化蛋白激酶、Cdk -細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶、Rb -視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白、TCA-三羧酸，IDH -異檸檬酸）[10]。為了靶向治療腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中被破壞的信號(hào)通路，研究者們?cè)O(shè)計(jì)合成了各種類型的藥物，包括小分子抑制劑（如替莫唑胺 TMZ, 多柔比星 DOX）[26-34]、抗體（如貝伐珠單抗 Bevacizumab）[7, 35-38]、核酸（如 siRNA, miRNA）[39-45]等，其中許多藥物已進(jìn)入臨床研究階段。由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤在治療中存在血腦屏障這一障礙，因此對(duì)藥物要求很高，一般采用對(duì)血腦屏障具有滲透性高或能適當(dāng)打開(kāi)它的小分子藥物進(jìn)行膠質(zhì)瘤治療（如瑞加德松）[46, 47]。1.3 siRNA 用于腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療

以實(shí)現(xiàn)特定的靶向功能。納米載體與 siRNA 通過(guò)靜電相互作用、誘捕或接合而產(chǎn)生的納米制劑的方法被稱為 siRNA 納米醫(yī)學(xué)[65]。目前為止，不同類型的納米粒子（如圖 1-2）已被廣泛開(kāi)發(fā)為 siRNA 遞送載體，包括有機(jī)聚合物（如膠束、納米凝膠、線性鏈、樹(shù)枝狀大分子等）、無(wú)機(jī)納米粒子（如金、量子點(diǎn)、二氧化硅等）、脂質(zhì)體，，外泌體、DNA 納米結(jié)構(gòu)載體以及融合了不同材料的雜化物等[66-71]。各種納米載體雖然具備高效的 siRNA 裝載能力，但在活體輸送中，并不能大量高效累積在病灶位點(diǎn)特異性靶向基團(tuán)的協(xié)助能夠使納米粒子準(zhǔn)確、快速和高效的到達(dá)腫瘤部位。這些靶向基團(tuán)包括小分子（如生物素、葉酸、半乳糖）[72]、多肽（如 Angiopep-2、cRGD、和 IL-13p[73, 74]和蛋白質(zhì)（如抗體、轉(zhuǎn)鐵蛋白）等[75]。靶向基團(tuán)的使用不僅使藥物被快速的遞送到病灶位點(diǎn)，減少對(duì)正常組織的副作用，還可通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用大大促進(jìn)細(xì)胞對(duì)藥物的攝取等[76]。近些年來(lái)仿生型生物膜也多被用來(lái)包裹納米粒子，以增強(qiáng)納米粒子在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性和特異靶向能力，其中癌細(xì)胞可通過(guò)同源歸航效應(yīng)準(zhǔn)確到達(dá)目標(biāo)腫瘤部位[47, 77]。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R739.4

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本文編號(hào)：2629616