【摘要】：惡性腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤作為最難以治療的腫瘤類型之一,由于生長位置的限制使得手術(shù)切割不徹底、容易壓迫神經(jīng)、損害正常人體功能等,目前對其仍無有效的臨床治療方案。用于膠質(zhì)瘤治療的藥物多種多樣,核酸類藥物如小干擾RNA(siRNA)作為近幾年的研究熱點,在腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療中占有一席之地。特別是近年來納米技術(shù)的飛速發(fā)展,極大提高了siRNA的遞送效率,加速了siRNA藥物的臨床轉(zhuǎn)化。但諸多遞送屏障如血液穩(wěn)定性、血腦屏障(BBB)、腫瘤主動富集及原位有效釋放等仍是目前亟需解決的科學難題�；诖�,本課題構(gòu)建了一種三重作用力(電荷、氫鍵、疏水)穩(wěn)定的siRNA納米藥物(3I-NM@siRNA),通過腦靶向配體Angiopep-2(Ang)的修飾,其具有膠質(zhì)母細胞瘤治療的潛質(zhì)。凝膠電泳實驗和動態(tài)激光光散射結(jié)果表明,相對于傳統(tǒng)的單重作用力(電荷)穩(wěn)定的siRNA納米藥物(1I-NM@siRNA),3I-NM@siRNA具有更好的siRNA包裹能力和壓縮能力,形成較小的納米顆粒(38納米)。生理穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示,3I-NM@siRNA在負電荷物質(zhì)肝素鈉的競爭下具有更好的穩(wěn)定性,其血液循環(huán)時間(半衰期38分鐘)相對于1I-NM@siRNA(半衰期8分鐘)也有較大程度的提高。同時,由于本實驗采用的疏水穩(wěn)定分子具有活性氧(ROS)響應性能,使得3I-NM@siRNA在模擬腫瘤微環(huán)境的條件下,能夠快速有效的釋放出裝載的siRNA藥物,從而發(fā)揮其治療效果。細胞實驗結(jié)果表明,通過Angiopep-2多肽配體的修飾,3I-NM@siRNA對于人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U87-MG具有很好的靶向能力。流式定量分析得到Ang-3I-NM@siRNA靶向效率是非靶向納米粒子的3.5倍。同時,熒光素酶RNA干擾細胞實驗進一步證實了其靶向性,Ang-3I-NM@siRNA的基因沉默效率到達80%,遠高于同樣條件下的非靶向納米粒子3I-NM@siRNA(50%)。另外,MTT實驗結(jié)果表明,Ang-3I-NM@siRNA納米顆�；緹o毒,具有良好的生物相容性。為驗證Ang-3I-NM@siRNA的治療效果,本論文針對Polo樣激酶-1(PLK1)為靶點進行了進一步的RNA干擾實驗。qRT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示,在siRNA濃度為200 nM的條件下,Ang-3I-NM@siRNA的基因沉默效率在mRNA和蛋白水平分別達到80%和63%,展現(xiàn)出良好的siRNA治療效果。為進一步驗證Ang-3I-NM@siRNA的靶向和治療效果,本論文構(gòu)建了原位人神經(jīng)膠質(zhì)瘤小鼠模型。siRNA納米藥物的體內(nèi)生物分布實驗結(jié)果表明,Ang-3I-NM@siRNA具有更好的神經(jīng)膠質(zhì)瘤靶向能力,在腫瘤部位的積累量是3I-NM@siRNA的二倍。選用siPLK1和siVEGFR2(VEGFR2:血管內(nèi)皮增長因子受體)兩種siRNA對神經(jīng)膠質(zhì)瘤小鼠進行治療實驗,結(jié)果表明,Ang-3I-NM@si(PLK1+VEGFR2)組小鼠的腫瘤增長最緩慢、體重變化最少且小鼠生存周期最長(52天)。腫瘤的組織學HE染色和TUNEL實驗結(jié)果表明,Ang-3I-NM@si(PLK1+VEGFR2)組具有最好的腫瘤細胞增殖抑制和殺傷效果。采用CD31(血小板-內(nèi)皮細胞粘附分子)標記血管,通過免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),Ang-3I-NM@siVEGFR2和Ang-3I-NM@si(PLK1+VEGFR2)組腫瘤中新生血管的數(shù)量相較于其它組明顯減少。通過以上治療結(jié)果可知,siPLK1和siVEGFR2具有協(xié)同治療腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤的效果。綜上所述,本論文成功構(gòu)建了一種三重作用力穩(wěn)定的腦靶向siRNA納米藥物,其具有較好的血液穩(wěn)定性、較高的腦腫瘤富集能力以及有效的腫瘤原位siRNA釋放。細胞和動物水平實驗證實了攜帶治療性siRNA的納米藥物具有很好的基因沉默和腫瘤生長抑制效果。此智能型siRNA納米藥物具有人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床治療的潛力。
【圖文】：

圖 1-1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤中被破壞的關(guān)鍵細胞通路的簡圖概述（縮寫:RTK -受體酪氨酸激酶、PTEN -磷酸酶和緊張素同源物、PI3K -磷酸肌醇激酶、VEGFR -血管內(nèi)皮生長因子受體、雷帕霉素 mTOR -哺乳動物靶蛋白、MAPK -絲裂原活化蛋白激酶、Cdk -細胞周期蛋白依賴性激酶、Rb -視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白、TCA-三羧酸，IDH -異檸檬酸）[10]。為了靶向治療腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中被破壞的信號通路，研究者們設計合成了各種類型的藥物，包括小分子抑制劑（如替莫唑胺 TMZ, 多柔比星 DOX）[26-34]、抗體（如貝伐珠單抗 Bevacizumab）[7, 35-38]、核酸（如 siRNA, miRNA）[39-45]等，其中許多藥物已進入臨床研究階段。由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤在治療中存在血腦屏障這一障礙，因此對藥物要求很高，一般采用對血腦屏障具有滲透性高或能適當打開它的小分子藥物進行膠質(zhì)瘤治療（如瑞加德松）[46, 47]。1.3 siRNA 用于腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療

以實現(xiàn)特定的靶向功能。納米載體與 siRNA 通過靜電相互作用、誘捕或接合而產(chǎn)生的納米制劑的方法被稱為 siRNA 納米醫(yī)學[65]。目前為止，不同類型的納米粒子（如圖 1-2）已被廣泛開發(fā)為 siRNA 遞送載體，包括有機聚合物（如膠束、納米凝膠、線性鏈、樹枝狀大分子等）、無機納米粒子（如金、量子點、二氧化硅等）、脂質(zhì)體，，外泌體、DNA 納米結(jié)構(gòu)載體以及融合了不同材料的雜化物等[66-71]。各種納米載體雖然具備高效的 siRNA 裝載能力，但在活體輸送中，并不能大量高效累積在病灶位點特異性靶向基團的協(xié)助能夠使納米粒子準確、快速和高效的到達腫瘤部位。這些靶向基團包括小分子（如生物素、葉酸、半乳糖）[72]、多肽（如 Angiopep-2、cRGD、和 IL-13p[73, 74]和蛋白質(zhì)（如抗體、轉(zhuǎn)鐵蛋白）等[75]。靶向基團的使用不僅使藥物被快速的遞送到病灶位點，減少對正常組織的副作用，還可通過受體介導的內(nèi)吞作用大大促進細胞對藥物的攝取等[76]。近些年來仿生型生物膜也多被用來包裹納米粒子，以增強納米粒子在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性和特異靶向能力，其中癌細胞可通過同源歸航效應準確到達目標腫瘤部位[47, 77]。
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R739.4

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