【摘要】：膠質(zhì)瘤是大腦最常見的原發(fā)性腫瘤,其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM,4級(jí)膠質(zhì)瘤)是最具侵襲性的的一種,目前幾乎沒(méi)有有效的治療方法[1-4]。在先前的研究中發(fā)現(xiàn)間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子(MET),在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中行使著重要的功能,在許多膠質(zhì)瘤患者中都出現(xiàn)了MET過(guò)度激活和基因的擴(kuò)增[5]。因此,針對(duì)MET的靶向治療日漸火熱并且有很多靶向MET基因的藥物已經(jīng)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)或已經(jīng)在臨床上開始使用,一部分藥物取得了一定的效果[6]。在中國(guó),中藥一直作為我們疾病治療的藥物中非常重要的一員。然而由于很多中藥缺乏機(jī)制的研究因此在國(guó)際上缺乏認(rèn)同。因此,對(duì)于中藥藥理機(jī)制的研究能夠?yàn)橹兴幫茝V提供重要的科學(xué)依據(jù)。癌癥作為當(dāng)代世界的一大醫(yī)學(xué)難題一直威脅著人類的生命健康。據(jù)報(bào)道,而由傳統(tǒng)中藥土貝母塊莖所提取的中藥單體土貝母苷甲1在膠質(zhì)瘤中能夠發(fā)揮其抗癌活性,但是其具體相關(guān)機(jī)制并不完善。因此,通過(guò)本課題的研究能夠進(jìn)一步完善其抗癌作用的具體機(jī)制。并且為膠質(zhì)瘤的治療提供一條潛在的途徑。本課題的主要發(fā)現(xiàn)如下:1.土貝母苷甲1影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖我們通過(guò)查閱先前的研究文獻(xiàn)[7],獲得藥物處理LN229以及U87細(xì)胞的適宜濃度。隨后設(shè)計(jì)所對(duì)應(yīng)的濃度區(qū)間對(duì)LN229和U87細(xì)胞進(jìn)行處理。通過(guò)顯微鏡對(duì)處理24h后的細(xì)胞觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn),LN229和U87細(xì)胞的數(shù)量隨著濃度的增高顯著減少。為了進(jìn)一步探究土貝母苷甲1對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖的影響。我們利用MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)得了以上兩種細(xì)胞系的生存曲線。其結(jié)果與上述結(jié)果一致。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)土貝母苷甲1能夠隨濃度梯度的上升抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖。2.土貝母苷甲1對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞周期的影響藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制往往體現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞周期的抑制上。因此,我們利用BrdU滯留實(shí)驗(yàn)檢測(cè)土貝母苷甲1對(duì)膠質(zhì)母瘤細(xì)胞瘤細(xì)胞DNA復(fù)制的影響。結(jié)果表明,添加土貝母苷甲1后能夠抑制細(xì)胞的DNA復(fù)制,隨后通過(guò)流式細(xì)胞分析和Western Blot實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)土貝母苷甲1能夠使LN229和U87細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。通過(guò)以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)土貝母苷甲1能夠使膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期,從而抑制細(xì)胞增殖。3.土貝母苷甲1對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖遷移的影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤其一大特點(diǎn)就是具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力[8]。因此,我們通過(guò)劃痕愈合實(shí)驗(yàn),以及Transwell實(shí)驗(yàn)對(duì)加藥處理后LN229和U87細(xì)胞遷移能力和侵襲能力進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)土貝母苷甲1處理后,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移侵襲能力受到了顯著的抑制,隨后利用Western Blot實(shí)驗(yàn)對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞的重要蛋白MMP-7,MMP-2,Snail和Slug進(jìn)行了檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)土貝母苷甲1能夠顯著下調(diào)上述蛋白的表達(dá)。通過(guò)以上結(jié)果分析,土貝母苷甲1能夠抑制遷移侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)從而抑制細(xì)胞的遷移侵襲能力。4.土貝母苷甲1對(duì)MET以及其重要下游通路的影響為了進(jìn)一步探究土貝母苷甲1對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖遷移影響的相關(guān)機(jī)制。我們利用Western Blot實(shí)驗(yàn)對(duì)相關(guān)通路的重要蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明,土貝母苷甲1能夠顯著抑制AKT,ERK蛋白的磷酸化水平并且抑制MET的蛋白水平。MET作為一種重要的絡(luò)氨酸受體激酶,其水平的降低能夠顯著抑制其下游相關(guān)通路的活性,因此我們采用過(guò)表達(dá)技術(shù),在LN229和U87細(xì)胞進(jìn)行MET的過(guò)表達(dá),在用藥物進(jìn)行處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)MET的上述細(xì)胞系能夠顯著減弱土貝母苷甲對(duì)細(xì)胞的增殖遷移的抑制。并且,AKT,ERK蛋白的磷酸化水平也有明顯的回復(fù)。為了探究土貝母苷甲1降低MET蛋白水平的相關(guān)機(jī)制,我們運(yùn)用了熒光定量PCR技術(shù)以及IP實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),MET蛋白水平的降低是由土貝母苷甲1所誘導(dǎo)的MET泛素化水平增高所引起。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們發(fā)現(xiàn),土貝母苷甲1能夠通過(guò)增加MET的泛素化水平從而下調(diào)其蛋白水平,最終影響MET下游通路的活性抑制膠質(zhì)母瘤細(xì)胞的增殖遷移能力。5.土貝母苷甲1對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞小鼠皮下成瘤能力的影響。為了進(jìn)一步驗(yàn)證土貝母苷甲1的抗腫瘤活性,我們?cè)O(shè)計(jì)了小鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們發(fā)現(xiàn),土貝母苷甲1能夠顯著抑制小鼠皮下腫瘤的生長(zhǎng)。并且,通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)分析土貝母苷甲能夠在小鼠體內(nèi)顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)標(biāo)志物Ki-67的表達(dá),而對(duì)MET蛋白水平的抑制也在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)得到了證明。通過(guò)以上結(jié)果我們發(fā)現(xiàn),土貝母苷甲1在小鼠體內(nèi)也具有明顯的抗腫瘤活性。綜上所述,土貝母苷甲1能夠通過(guò)誘導(dǎo)MET的泛素化降解抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖,遷移能力。并且,能夠在小鼠體內(nèi)皮下腫瘤中也能夠靶向MET,進(jìn)而行使其抗腫瘤活性。通過(guò)本課題的研究對(duì)土貝母苷甲1的抗腫瘤活性機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的闡釋,能夠?yàn)樵谀z質(zhì)母細(xì)胞瘤的靶向MET的治療方法提供一條新的潛在途徑。
【圖文】：

其中最為常見的就是癌癥的發(fā)生。借助于基因組時(shí)臨床實(shí)踐中下一代測(cè)序（NGS）的實(shí)施，幾乎所有2]。通過(guò)遺傳圖譜的分析，我們發(fā)現(xiàn)在腫瘤中存在著包括 EGFR, HER2/ErbB2, MET 等。而這些重要基療提供了新的思路。因此，對(duì)于癌癥細(xì)胞中 RTK 功件下 RTK 的激活機(jī)制RTK 的激活依賴其特定的配體。當(dāng)特異性配體與 R。RTK 活性被激活從而行使其相關(guān)功能[13]（圖 1過(guò)與配體結(jié)合所產(chǎn)生的構(gòu)象變化使得酪氨酸激酶區(qū)身抑制[14]。這種構(gòu)象變化也能夠使得酪氨酸激酶區(qū)募集和激活多種下游信號(hào)蛋白，其中包括 Src 同源（PTB）結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域與受體內(nèi)的特定磷酸關(guān)鍵細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的下游通路中[14]。

的信息交流主要通過(guò)由分泌細(xì)胞分泌如生長(zhǎng)因子等信號(hào)分完成。而細(xì)胞的自分泌針對(duì)的是細(xì)胞能夠自行分泌這些信40]。如果細(xì)胞持續(xù)地進(jìn)行自分泌那么則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞克隆增而這種自分泌現(xiàn)象在多種癌癥中都已有了十分透徹的研究FR[42]、HGF-MET[43, 44]以及 SCF-KIT[45-47]自分泌循環(huán)能夠與其他自分泌生長(zhǎng)通路協(xié)同參與到腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)通路很可能成為又一個(gè)癌癥治療的重要靶點(diǎn)[42]。母苷甲抗腫瘤研究進(jìn)展直以來(lái)都是我們國(guó)家醫(yī)藥文化的一筆重要的財(cái)富。在我國(guó)藥可以說(shuō)是經(jīng)受住了歷史的考驗(yàn)。為我國(guó)人民的疾病治療。而其中，，有些中藥在腫瘤的治療過(guò)程中也展示出了其獨(dú)究的土貝母苷甲 1（圖 1.2）就是由干燥的土貝母塊莖中所活性中藥單體。除此之外，得率高的還有土貝母苷甲 2 以
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R739.41

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本文編號(hào)：2627872