【摘要】：研究背景:p35經(jīng)蛋白酶calpain裂解產(chǎn)生N-端p10和C-端p25。相比于p35,p25半衰期更長、細胞內(nèi)活動范圍更廣、與Cdk5結(jié)合更緊密,因而p25更易于結(jié)合和活化Cdk5、導(dǎo)致Cdk5下游的關(guān)鍵底物過度磷酸化,進而導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。CIP是p35的截短片段。在體內(nèi)外實驗中發(fā)現(xiàn),CIP能特異性地抑制Cdk5/p25復(fù)合物的活性。前期研究中,我們證實了使用AAV9介導(dǎo)CIP干預(yù)APP/PS1模型鼠能有效改善小鼠的記憶衰退及焦慮樣行為,并減少Tau蛋白磷酸化、Aβ沉淀的產(chǎn)生。我們在MPTP/p誘導(dǎo)的帕金森病模型鼠上進行的研究也進一步證實了 AAV9-CIP能有效減少小鼠神經(jīng)元丟失和改善運動及焦慮樣癥狀。研究目的:1.建立以AAV8-GFP-p25誘導(dǎo)的p25過表達模型鼠;2.觀察這些p25過表達模型鼠的病理變化和行為變化特點;3.分組實驗觀察AAV9-CIP能否改善AAV8-GFP-p25誘導(dǎo)的p25過表達模型鼠的病理改變;4.進行行為學(xué)實驗,通過實驗結(jié)果分析AAV9-CIP改善AAV8-GFP-p25誘導(dǎo)的p25過表達模型鼠的異常行為的效果。研究方法:1.使用相應(yīng)的質(zhì)粒來構(gòu)建AAV病毒載體及相應(yīng)的病毒包裝;2.在小鼠8周齡時,AAV8-GFP-p25鼠腦側(cè)腦室注射方案進行p25過表達模型鼠構(gòu)建;3.在AAV8-GFP-p25注射后1月,進行AAV9-CIP鼠腦同側(cè)側(cè)腦室注射干預(yù)處理;4.在小鼠6月齡時,行為學(xué)檢測分析各組小鼠行為學(xué)變化特點;5.通過Western blot及鼠腦組織切片行免疫組化分析分別觀察AAV8-GFP-p25模型鼠、AAV9-CIP干預(yù)鼠的相應(yīng)的蛋白表達水平變化和病理變化;6.統(tǒng)計學(xué)分析:研究中所有的數(shù)據(jù)都使用了SPSS20.0、Image J和GraphPad Prism 6.05統(tǒng)計分析軟件來進行統(tǒng)計。除主動回避反應(yīng)實驗使用重復(fù)測量分析方法以外,其他數(shù)據(jù)使用組間單因素分析方法。各組數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式在統(tǒng)計圖中呈現(xiàn),當(dāng)P值0.05時,可認為有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果:1.在AAV8-GFP-p25誘導(dǎo)的p25過表達模型鼠中發(fā)現(xiàn),小鼠腦組織中出現(xiàn)Tau蛋白多個位點上的過磷酸化現(xiàn)象,并且伴有星形膠質(zhì)細胞的活化和炎性因子白細胞介素-1、腫瘤壞死因子-α表達水平的增高;2.行為學(xué)實驗顯示,AAV8-GFP-p25誘導(dǎo)的p25過表達模型鼠可表現(xiàn)出明顯的學(xué)習(xí)能力的下降和焦慮樣行為;3.經(jīng)AAV9-CIP側(cè)腦室注射干預(yù)處理的p25過表達模型鼠可觀察到上述病理現(xiàn)象的改善和炎性因子的表達減少,并且能緩解小鼠學(xué)習(xí)能力的衰退。結(jié)論:1.AAV8-GFP-p25可以誘導(dǎo)以學(xué)習(xí)能力衰退和焦慮樣行為為主要行為特點的p25過表達模型鼠。2.通過AAV8-GFP-p25誘導(dǎo)的模型鼠將更易于建立,節(jié)省時間和資金。重要的是在小鼠成年后在p25導(dǎo)致神經(jīng)毒性后再進行CIP治療,更加能模擬臨床的實際情況。3.AAV9-CIP的干預(yù)處理能有效減少此p25過表達模型鼠病理現(xiàn)象的發(fā)生及炎性現(xiàn)象產(chǎn)生,也能有效緩解其學(xué)習(xí)能力的衰退現(xiàn)象。這些結(jié)果表明AAV病毒介導(dǎo)的CIP能有效靶向抑制p25的神經(jīng)毒性。
【圖文】：

導(dǎo)的ｐ２５過表達鼠中也發(fā)現(xiàn)了邋Ｔａｕ蛋白的Ｓｅｒｌ９９，Ｓｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５和Ｔｈｒ２３１逡逑位點上存在過磷酸化現(xiàn)象［Ｓ７＇邋Ｓ８：。因此在本實驗中也對這三個磷酸化位點進行了逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測。如圖３－３－２．邋Ｂ所示通過側(cè)腦室注射ＡＡＶ８－ＧＦＰ－ｐ２５病毒的小逡逑鼠鼠腦組織中的Ｔａｕ蛋白在Ｓｅｒｌ９９，邋Ｓｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５邋（用ＡＴ－８抗體檢測）和逡逑Ｔｈｒ２３１（用ＡＴ１８０抗體檢測）位點上的磷酸化程度明顯增加。而在進行了邋ＡＡＶ９－ＣＩＰ逡逑３４逡逑

圖３－３．邋ＡＡＶ９－ＣＩＰ的干預(yù)處理能夠抑制ｐ２５介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥發(fā)生逡逑圖中所有的腦組織裂解液和組織切片都在小鼠６月齡時取材制作的逡逑Ａ圖和Ｂ圖中在小鼠海馬區(qū)的ＧＦＡＰ免疫組化染色。ｐ２５／ｖｅｃｔｏｒ組小鼠比對照組顯示出逡逑了更高的邋ＧＦＡＰ邋含量（４０．邋８２邋±邋１．４９９邋ｖｓ．邋２６．邋４４邋±邋２．邋３３７，，ｐ＝０．邋００２）；并且這種邋ＧＦＡＰ逡逑３８逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R741

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本文編號：2623678