【摘要】：研究背景神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells,NSCs)是一群能自我更新并具有多種分化潛能的細(xì)胞,可分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等,有研究已經(jīng)證實(shí)NSCs可以定向分化以修復(fù)和替代死亡的神經(jīng)細(xì)胞,用于移植治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,但其增殖和分化過(guò)程的調(diào)控因素尚不清楚。自噬是指在營(yíng)養(yǎng)缺乏或者受到外界應(yīng)激情況下細(xì)胞降解自身的一些成分獲得營(yíng)養(yǎng)存活下來(lái)的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn),自噬是細(xì)胞內(nèi)蛋白降解的主要途徑之一,有利于胞漿成分和細(xì)胞器的更新,主要降解內(nèi)源性長(zhǎng)壽命蛋白及蛋白聚集體,還可降解受損傷的細(xì)胞器,從而為細(xì)胞生長(zhǎng)提供氨基酸、ATP等物質(zhì)。自噬被認(rèn)為是細(xì)胞適應(yīng)饑餓的一種方式,也被認(rèn)為在細(xì)胞質(zhì)組分正常更新中起著重要的作用,特別在神經(jīng)系統(tǒng)中,自噬對(duì)神經(jīng)退行性疾病起到保護(hù)作用。在干細(xì)胞分化過(guò)程中,存在調(diào)控干細(xì)胞特性的蛋白被降解,而具有分化細(xì)胞特性的蛋白質(zhì)被生成的過(guò)程,自噬作為細(xì)胞降解內(nèi)源性蛋白質(zhì)的一種機(jī)制參與到增殖分化的過(guò)程中。目前較多的研究集中在腫瘤干細(xì)胞的自噬上,而NSCs的自噬水平研究還比較少見(jiàn),有文獻(xiàn)報(bào)道神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)一定的自噬水平,而神經(jīng)分化能激活自噬。Fonseca MB等發(fā)現(xiàn)采用藥物降低自噬水平能夠降低Aβ誘導(dǎo)的NSCs定向分化,這表明自噬可能在NSCs分化過(guò)程中起到一定的作用,但是自噬究竟在NSCs增殖分化過(guò)程中起到什么樣的作用尚不清楚。Notch1信號(hào)通路在胚胎發(fā)生和干細(xì)胞增殖、分化以及干細(xì)胞干性的維持方面起著細(xì)胞通訊的作用,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Notch1信號(hào)參與了NSCs的增殖和分化過(guò)程。有研究發(fā)現(xiàn)Notch1信號(hào)受到自噬水平的調(diào)控。因此,為了探明NSCs增殖分化過(guò)程中自噬的作用和機(jī)制,我們檢測(cè)在NSCs分化不同時(shí)間點(diǎn)自噬水平的變化,并且用藥物分別誘導(dǎo)和抑制NSCs自噬水平,檢測(cè)不同自噬水平對(duì)NSCs增殖和凋亡的影響,并對(duì)其中的機(jī)制進(jìn)行了探討,檢測(cè)了Notch1的表達(dá)水平。研究目的本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)旨在研究NSCs分化過(guò)程中自噬水平的變化及自噬水平變化對(duì)NSCs增殖和凋亡的影響及機(jī)制,為NSCs應(yīng)用于臨床提供更深入的理論基礎(chǔ)。方法1.NSCs的分離及培養(yǎng):取新生C57BL/6小鼠海馬組織進(jìn)行原代培養(yǎng),每三天半量換液。神經(jīng)球長(zhǎng)至200μm左右時(shí)進(jìn)行傳代,采用Accutase酶原液+機(jī)械吹打法進(jìn)行傳代。2.采用免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)NSCs進(jìn)行鑒定:神經(jīng)球貼片后,經(jīng)NSCs特異性標(biāo)記物巢蛋白(Neuroepithelial stem cell protein,Nestin)抗體免疫熒光染色,倒置熒光顯微鏡下觀察。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NSCs中Nestin陽(yáng)性細(xì)胞百分比。3.NSCs分化過(guò)程中自噬水平的測(cè)定:采用Western blot技術(shù)檢測(cè)NSC分化過(guò)程中第0天、1天、3天、7天自噬標(biāo)記性蛋白微管相關(guān)蛋白1的輕鏈3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)的表達(dá)變化情況。4.NSCs分別經(jīng)1μM、5μM、10μM雷帕霉素(Rapamycin,RPM)和10μM、30μM氯喹(Chloroquine,CQ)處理24小時(shí),采用Western blot檢測(cè)NSCs中LC3的表達(dá)變化。5.NSCs分別經(jīng)RPM(μM:1、5、10)和CQ(μM:10、30)處理24小時(shí)后,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期、Ki-67、Caspase-3(Cysteinyl aspartate specific proteinase 3)的表達(dá)情況。6.NSCs分別經(jīng)RPM(μM:1、5、10)和CQ(μM:10、30)處理24小時(shí)后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Notch1的表達(dá)變化情況。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。使用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)檢測(cè)組間差異,以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.體外成功培養(yǎng)新生的C57BL/6小鼠海馬區(qū)NSCs,新鮮分離的細(xì)胞為單細(xì)胞狀態(tài),3天后開(kāi)始形成神經(jīng)球,20天左右進(jìn)行傳代,之后6天傳代一次。2.NSCs的鑒定:免疫熒光染色結(jié)果表明第三代神經(jīng)球表達(dá)NSCs特異性標(biāo)記物Nestin,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Nestin陽(yáng)性細(xì)胞百分比為95%以上。3.Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值在NSCs分化第1天先升高之后開(kāi)始降低,其中分化第1天和第0天相比LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值有顯著性差異(**P0.01)。和第0天相比,分化第3天和第7天的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.Western blot結(jié)果顯示NSCs中加入RPM(μM:1、5、10)后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值隨著RPM濃度的升高而增加,與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(#P0.05,~(##)P0.01);NSCs經(jīng)CQ(μM:10、30)刺激后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值也隨著刺激濃度的升高而增加,與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P0.05,~(**)P0.01)。5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果和Ki-67結(jié)果:NSCs經(jīng)RPM(μM:1、5、10)處理24小時(shí)后,S+G2M期的比例隨著RPM濃度的升高而降低,其中1μM、5μM和10μM RPM處理組的細(xì)胞S+G2M期的比例分別為42.23±1.08%、40.48±0.38%、25.35±1.18%,和對(duì)照組44.97±0.78%相比具有顯著性差異(~*P0.05,~(***)P0.001),經(jīng)CQ(μM:10、30)處理后,S+G2M期的比例與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Ki-67的陽(yáng)性細(xì)胞百分比隨著RPM濃度的升高而降低,其中5μM和10μM RPM處理組Ki-67的陽(yáng)性細(xì)胞百分比分別為26.60±7.13%和21.53±6.46%,和對(duì)照組33.87±1.01%相比具有顯著性差異(~*P0.05),CQ組和對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Caspase-3表達(dá)水平:NSCs經(jīng)RPM(μM:1、5、10)和CQ(μM:10、30)處理24h后,Caspase-3平均熒光強(qiáng)度隨著RPM濃度的升高而升高,其中10μM RPM處理組Caspase-3平均熒光強(qiáng)度為754.67±75.18,與對(duì)照組592.33±25.42相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(~*P0.05),CQ處理組和對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Notch1表達(dá)水平:NSCs經(jīng)RPM(μM:1、5、10)和CQ(μM:10、30)處理24h后,Notch1平均熒光強(qiáng)度隨著RPM濃度的升高而降低,其中5μM、10μM RPM處理組Notch1平均熒光強(qiáng)度分別為5354.67±146.5、3775.67±139.61與對(duì)照組6186.33±246.07相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(~(**)P0.01,~(***)P0.001),CQ處理組和對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1 NSCs在分化過(guò)程中自噬水平先升高后降低。2自噬水平增加抑制NSCs的增殖,促進(jìn)了NSCs的凋亡,這可能與Notch1的表達(dá)降低有關(guān)。
【圖文】：

觀察發(fā)現(xiàn)神經(jīng)球增殖迅速，直徑增加，可至 200μm 左右（圖3.1C）。NSCs 傳代后，培養(yǎng)基中細(xì)胞碎片減少，細(xì)胞增殖良好（圖 3.1D）。當(dāng)NSCs 傳至第三代時(shí)，消化后為單個(gè)透明圓球狀的 NSCs，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（3.1E）。

15熒光，Nestin蛋白發(fā)紅色熒光（圖3.2A）。結(jié)果表明體外培養(yǎng)的神經(jīng)球表達(dá) Nestin蛋白。進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NSCs的陽(yáng)性細(xì)胞百分比為95%以上。表明我們采用的培養(yǎng)方法可以培養(yǎng)出高純度的NSCs。圖 3.2 免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)海馬區(qū) NSCs 進(jìn)行鑒定和純度檢測(cè)A 為免疫細(xì)胞熒光圖，B 為流式對(duì)照，C 為NSCs Nestin陽(yáng)性細(xì)胞百分比流式檢測(cè)結(jié)果，其中B、C 圖的橫坐標(biāo)為PE的熒光強(qiáng)度。Scale bar=50μm3.3 NSCs 的分化在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)NSCs分化第0d（圖3.3.1A），細(xì)胞大多處于單細(xì)胞狀態(tài)，，細(xì)胞圓形透明，折光度好。分化第1d（圖3.3.1B）多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)始貼壁，細(xì)胞由圓形變成扁平狀，開(kāi)始有突起的形成。分化第3d（圖3.3.1C）和第1d相比
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R741

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2623034