【摘要】：研究背景鐵是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System,CNS)維持正常生理功能所必需的元素,其在氧的轉(zhuǎn)運、DNA合成、髓鞘形成、線粒體呼吸作用和神經(jīng)遞質(zhì)生成中均具有重要作用。然而,細胞內(nèi)游離的亞鐵離子可與內(nèi)源性的過氧化氫反應(yīng)生成反應(yīng)性活性氧簇(Reactive Oxygen Species,ROS),因此,神經(jīng)細胞內(nèi)亞鐵離子的沉積可導(dǎo)致氧化應(yīng)激(Oxidative Stress,OS)與炎癥反應(yīng),進而造成神經(jīng)損傷。由此可見神經(jīng)細胞內(nèi)的鐵穩(wěn)態(tài)是CNS維持正常生理功能的必要條件。先前的研究發(fā)現(xiàn):在腦出血(Intracerebral Hemorrhage,ICH)、腦缺血、創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic Brain Injury,TBI)及阿爾茨海默氏病(Alzheimer's Diseas,AD)、帕金森病(Parkinson's Disease,PD)、亨廷頓病(Huntington's Disease,HD)等多種神經(jīng)退行性疾病患者的腦內(nèi)均存在鐵的過量沉積,提示亞鐵離子導(dǎo)致的神經(jīng)損傷在這些疾病的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。叔丁基氫醌(Tert-Butylhydroquinone,tBHQ)是常用的食品抗氧化劑—丁基羥基茴香醚的一種代謝物,研究表明tBHQ能激活NF-E2相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)原件(NF-E2-Related Factor2/Antioxidant Response Element,Nrf2/ARE)通路。該通路是細胞維持自身氧化還原穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵通路,生理狀態(tài)下,Kelch-Like ECH-AssociatedProtein-1(Keap1)蛋白將Nrf2固定于細胞質(zhì)中,同時還會誘導(dǎo)Nrf2的泛素化,泛素化的Nrf2會被迅速降解,從而將Nrf2/ARE通路的活性維持在生理水平。在發(fā)生OS時,Keap1的構(gòu)象會發(fā)生改變,使其失去對Nrf2的泛素化作用,從而使Nrf2免于泛素化降解,新合成的Nrf2在胞質(zhì)內(nèi)聚集,并能夠轉(zhuǎn)位至細胞核中,細胞核內(nèi)的Nrf2與ARE結(jié)合,進而促進血紅素氧化酶1(Heme Oxygenase-1,Hmox-1)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(Glutathione Transferases,GSTs)、谷胱甘肽過氧化物酶1(Glutathione Peroxidase-1,Gpx1)和NAD(P)H醌氧化還原酶1[NAD(P)H quinone oxidoreductase-1,Nqo1]等多種抗氧化酶的表達。tBHQ可改變Keap1-Nrf2復(fù)合物的構(gòu)象,抑制Keap1介導(dǎo)的Nrf2泛素化,從而提高Nrf2的穩(wěn)定性。tBHQ在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型中均具有保護作用,此外,tBHQ已經(jīng)獲批可應(yīng)用于人類。但tBHQ在亞鐵離子導(dǎo)致的神經(jīng)損傷中的作用仍有待深入研究。過氧化物還原酶(Peroxiredoxin,Prdx)家族隸屬于硫氧還原蛋白系統(tǒng),是一類巰基過氧化物酶。其可通過清除細胞內(nèi)的過氧化物從而發(fā)揮抗氧化的作用,此外,Prdx還能在多種炎性疾病中發(fā)揮抗炎作用。哺乳動物的Prdx家族包括6個成員,分別命名為Prdx1-6,其中Prdx2在CNS內(nèi)含量最為豐富,這使其成為Prdx家族在腦內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用的主要成員。已有研究證實Prdx2能夠在腦缺血、AD和PD中發(fā)揮保護作用,但Prdx2在亞鐵離子導(dǎo)致的神經(jīng)損傷中的作用仍不清楚。PC12細胞在形態(tài)、生理和生化等方面具有神經(jīng)元的特性,因而被廣泛用于神經(jīng)生理、神經(jīng)毒理、神經(jīng)保護和神經(jīng)認知等方面的體外研究。已有研究證實亞鐵離子溶液能夠誘導(dǎo)PC12細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化和細胞死亡。因此,在本課題中,我們使用硫酸亞鐵(Ferrous Sulfate,FS)刺激的PC12細胞作為研究亞鐵離子神經(jīng)損傷的體外模型。本課題包括兩部分,第一部分:使用FS刺激tBHQ預(yù)處理的PC12細胞,研究tBHQ對細胞損傷和凋亡的作用及其機制,隨后,向大鼠紋狀體內(nèi)立體定向注射FS溶液來構(gòu)建亞鐵離子神經(jīng)損傷動物模型,從而在體內(nèi)水平研究tBHQ對于亞鐵離子神經(jīng)損傷的作用;第二部分:首先檢測FS對于PC12細胞中Prdx2表達的影響,然后在FS處理前,使用慢病毒敲低PC12細胞中Prdx2的含量,進而研究Prdx2在亞鐵離子導(dǎo)致的神經(jīng)損傷中的作用。期望通過以上研究,為腦卒中、TBI、神經(jīng)退行性疾病等多種伴有鐵沉積的CNS疾病提供新的治療靶點。第一部分:tBHQ在亞鐵離子導(dǎo)致的神經(jīng)損傷中的作用機制研究目的:在體內(nèi)、體外水平研究tBHQ能否改善亞鐵離子導(dǎo)致神經(jīng)損傷;使用體外實驗研究tBHQ的神經(jīng)保護作用是否依賴于Nrf2/ARE通路。方法:1.細胞培養(yǎng):大鼠PC12細胞系,給予含有10%馬血清和5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基作常規(guī)培養(yǎng)。2.FS作用濃度與作用時間的確定:使用不同濃度(1 μ mol/L、2 μmol/L、5 μmol/L、10 μ mol/L、20 μ mol/L)的FS溶液刺激PC12細胞24h,然后使用CCK-8實驗檢測細胞活力,選擇將細胞活力降低50%以上的最低濃度作為后續(xù)實驗的刺激濃度,然后使用該濃度刺激PC12細胞不同的時間(3h、6h、12h、24h、36h),使用CCK-8檢測細胞活力,然后根據(jù)結(jié)果選擇最適的作用時間。3.細胞實驗分組:在明確了 FS的最適作用濃度與時間后,按不同的處理方式,將細胞分為Ctrl組、tBHQ處理組(40 μmol/L tBHQ作用40h)、FS刺激組(10μmol/L FS 處理 24h)和 tBHQ+FS 組(40 μmol/L tBHQ 預(yù)處理 16h,再給予 40 μmol/LtBHQ 和 10 μmol/LFS 刺激 24h)。4.檢測細胞內(nèi)亞鐵離子的含量:刺激完成后,將各組細胞裂解,先使用BCA法檢測各組的蛋白濃度,然后使用菲洛嗪法檢測裂解液中亞鐵離子的濃度。5.細胞損傷和細胞凋亡檢測:分別使用乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)釋放實驗和流式細胞凋亡檢測來衡量PC12細胞的損傷和凋亡情況。6.凋亡相關(guān)蛋白的檢測:使用Western Blot檢測PC12細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Cytochrome C 和 Cleaved Caspase-3 的表達。7.OS相關(guān)指標的檢測:使用2',7'-Dichlorofluorescin diacetate(DCFH-DA)染色測量細胞內(nèi)ROS的含量;檢測細胞內(nèi)丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和γ-Histone H2A.X的水平來分別衡量PC12細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化和DNA氧化損傷的程度。8.炎癥反應(yīng)相關(guān)指標的檢測:使用Western Blot檢測細胞核蛋白中核因子Kappa B p65(Nuclear Factor Kappa B p65,NF-κB p65)及細胞總蛋白中 I kappa B a(IκBa)和環(huán)氧合酶 2(Cyclooxygenase-2,COX-2)的含量;使用 ELISA檢測細胞上清中腫瘤壞死因子a(Tumor Necrosis Factor-a,TNF-a)和白細胞介素 1 β(Interleukin-1β,IL-1β)的水平。9.Nrf2蛋白核轉(zhuǎn)位與基因轉(zhuǎn)錄的檢測:使用Western Blot檢測胞核、胞漿蛋白中Nrf2的含量;使用qRT-PCR檢測各組細胞中Nrf2 mRNA的水平。10.檢測Nrf2下游蛋白的表達情況:使用Western Blot檢測Nrf2下游蛋白Hmox-1、Nqo1 和 Gpx1 的表達。11.檢測tBHQ的保護作用是否依賴于Nrf2/ARE通路:向PC12細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA,使用Western Blot檢測Nrf2 siRNA的轉(zhuǎn)染效率,之后使用LDH釋放實驗觀察敲低Nrf2能否消除tBHQ的保護作用。12.實驗動物分組:按不同的處理方式,將Wistar大鼠隨機分為Sham組、tBHQ處理組、FS損傷組和tBHQ+FS組;對于tBHQ處理組和tBHQ+FS組,在顱內(nèi)立體定向注射前24h,按照3.33mL/kg的劑量,向大鼠腹腔內(nèi)注射含30mmol/LtBHQ的生理鹽水,每8h一次,共三次;而對于Sham組和FS損傷組,則按照同樣的方式注射等量的不含tBHQ的生理鹽水。13.動物模型的構(gòu)建:顱內(nèi)立體定向注射在首次腹腔注射后24h進行,向FS損傷組和tBHQ+FS組大鼠右側(cè)紋狀體內(nèi)注射10 μ L含1mmol/L FS的生理鹽水;而對于Sham組和tBHQ處理組,則以同樣的方式注射等量不含F(xiàn)S的生理鹽水。14.檢測腹腔注射tBHQ對大鼠紋狀體內(nèi)Nrf2基因轉(zhuǎn)錄和蛋白核轉(zhuǎn)位的影響:提取Sham組和tBHQ處理組大鼠右側(cè)紋狀體內(nèi)的胞核、胞漿蛋白及總RNA,使用Western Blot檢測胞核、胞漿蛋白中Nrf2的含量,使用qRT-PCR檢測Nrf2 mRNA的水平。15.大鼠紋狀體內(nèi)脂質(zhì)過氧化和炎癥反應(yīng)相關(guān)指標的檢測:使用ELISA檢測紋狀體內(nèi)4-羥基壬烯酸(4-Hydroxynonenal,4-HNE)的含量;使用免疫組化檢測大鼠紋狀體內(nèi) NF-κ B p65 和 Ionized Calcium-Binding Adapter Molecule 1(Iba1)的表達。16.大鼠紋狀體內(nèi)細胞凋亡及損傷體積的檢測:使用TUNEL染色檢測紋狀體內(nèi)的細胞凋亡;對于損傷體積的檢測,將固定好的鼠腦置于腦切片模具上,沿注射針孔所在冠狀平面將腦切開,然后在此平面前后每隔2mm做連續(xù)冠狀切,直到切面上無損傷為止,將每個平面進行拍照,使用ImageJ計算出每個切面上損傷的面積,求和,然后乘以前后兩張切片的距離,即得損傷體積。17.大鼠神經(jīng)功能障礙的檢測:使用24分制的神經(jīng)功能評分量表進行神經(jīng)功能障礙檢測。結(jié)果:1.FS作用濃度與時間的確定:FS的作用濃度越高,PC12細胞的活力就下降得越明顯,10 μ mol/L FS作用24h可將細胞活力下降55%;在10 μ mol/L FS刺激PC12的24h小時內(nèi),細胞活力迅速下降,但在24-36h,細胞活力的降幅明顯減小。于是我們在后續(xù)實驗中使用10 μ mol/L的FS處理細胞24h。2.FS可以顯著升高PC12細胞內(nèi)亞鐵離子的濃度:菲洛嗪法顯示10 mol/LFS溶液作用24h可將PC12細胞內(nèi)亞鐵離子的濃度升高10倍以上。而tBHQ對FS刺激的PC12細胞內(nèi)的亞鐵離子濃度無明顯影響。3.tBHQ可抑制FS導(dǎo)致的PC12細胞損傷和凋亡:FS可升高培養(yǎng)基中LDH的含量,而tBHQ可抑制FS的這一效應(yīng);FS能將PC12細胞的凋亡率由3.75%升至13.30%,而tBHQ預(yù)處理則可將凋亡率降至9.08%。4.tBHQ可抑制FS導(dǎo)致的PC12細胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達升高:FS可升高PC12細胞中Bax的表達,同時降低Bcl-2的表達,從而升高Bax/Bcl-2表達比,此外,FS還能升高Cytochrome C和Cleaved Caspase-3的表達;tBHQ預(yù)處理可抑制 FS 導(dǎo)致的 Bax/Bcl-2 表達比升高,以及 Cytochrome C 和 Cleaved Caspase-3的表達升高。5.tBHQ可抑制FS導(dǎo)致的PC12細胞內(nèi)的OS:DCFH-DA染色顯示tBHQ可抑制FS導(dǎo)致的ROS產(chǎn)生;此外,tBHQ可抑制FS導(dǎo)致的MDA和γ-Histone H2A.X含量的升高,表明tBHQ可緩解FS導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化和DNA氧化損傷。6.tBHQ可抑制FS導(dǎo)致的PC12細胞內(nèi)的炎癥反應(yīng):通過檢測PC12細胞胞核蛋白中NF-κ B p65的含量來評估其核轉(zhuǎn)位情況,FS可升高細胞核蛋白中NF-κ B p65的水平,并促進IKBa的磷酸化,而tBHQ則可抑制FS誘導(dǎo)的NF-κB p65核轉(zhuǎn)位和I κ B a的磷酸化;PC12細胞中COX-2、TNF-α、IL-1 β的表達在FS處理后均顯著升高,而tBHQ則可抑制這一效應(yīng)。7.tBHQ促進PC12細胞中Nrf2核轉(zhuǎn)位,但會減弱FS對Nrf2轉(zhuǎn)錄及表達的促進作用:tBHQ單獨作用能升高胞核蛋白中Nrf2的水平,同時降低胞漿蛋白中Nrf2的含量;FS單獨作用能同時升高胞核與胞漿蛋白中Nrf2的含量,但tBHQ預(yù)處理能夠抑制這一現(xiàn)象。qRT-PCR結(jié)果顯示tBHQ單獨作用對Nrf2的轉(zhuǎn)錄無明顯影響,而FS可以明顯升高Nrf2 mRNA水平,但這一效應(yīng)可被tBHQ預(yù)處理所抑制。8.tBHQ促進PC12細胞中Nrf2下游蛋白的表達,但會減弱FS對這些蛋白表達的促進作用:tBHQ單獨作用能促進Nrf2下游蛋白Hmox-1、Nqo1和Gpx1的表達,而FS單獨作用可更明顯地升高這三者的水平,但tBHQ預(yù)處理則會抑制FS導(dǎo)致的Hmox-1、Nqo1和Gpx1的表達升高。9.tBHQ對FS刺激的PC12細胞的保護作用是依賴于Nrf2/ARE通路的:向PC12細胞中轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA,Western Blot和qRT-PCR結(jié)果顯示Nrf2 siRNA能明顯降低PC12細胞中Nrf2蛋白和mRNA的水平;LDH釋放實驗顯示:對于轉(zhuǎn)染了 Ctrl siRNA和Nrf2 siRNA的PC12細胞,FS對后者的損傷作用更強,表明Nrf2/ARE通路在PC12細胞抵御亞鐵離子毒性的過程中具有重要作用;此外,Nrf2 siRNA能夠消除tBHQ對PC12細胞的保護作用,這一結(jié)果表明tBHQ對FS刺激的PC12細胞的保護作用是依賴于Nrf2/ARE通路的。10.tBHQ腹腔注射能促進大鼠紋狀體內(nèi)Nrf2的核轉(zhuǎn)位,但對Nrf2的基因轉(zhuǎn)錄無明顯影響:Western Blot顯示tBHQ能升高大鼠紋狀體內(nèi)細胞細胞核中Nrf2的含量,同時降低細胞質(zhì)中Nrf2的水平;qRT-PCR結(jié)果顯示tBHQ對大鼠紋狀體內(nèi)Nrf2 mRNA的水平無明顯影響。11.tBHQ腹腔注射能緩解FS導(dǎo)致的大鼠紋狀體內(nèi)的OS及炎癥反應(yīng):顱內(nèi)注射FS能顯著升高紋狀體內(nèi)脂質(zhì)過氧化副產(chǎn)物-4-HNE的水平,而tBHQ則可抑制FS導(dǎo)致的4-HNE的升高;免疫組化顯示顱內(nèi)注射FS能促進NF-κ B和小膠質(zhì)細胞的活化,而這一現(xiàn)象能夠被tBHQ腹腔注射所抑制。12.tBHQ腹腔注射能改善FS導(dǎo)致的紋狀體內(nèi)的細胞凋亡和大鼠神經(jīng)功能障礙,但對損傷體積無明顯影響:相比于FS損傷組,tBHQ+FS組的TUNEL陽性細胞比率和神經(jīng)功能障礙評分明顯降低;但兩組的損傷體積無明顯差異。結(jié)論:1.亞鐵離子刺激可引起神經(jīng)氧化及炎性損傷,進而導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡。2.tBHQ可改善亞鐵離子導(dǎo)致的神經(jīng)氧化及炎性損傷,并能減少細胞凋亡,改善神經(jīng)功能障礙,從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。3.tBHQ的神經(jīng)保護作用是依賴于Nrf2/ARE通路的。第二部分過氧化物還原酶2在亞鐵離子導(dǎo)致的神經(jīng)損傷中的作用機制研究目的:研究PC12細胞內(nèi)的Prdx2在亞鐵離子刺激后的變化情況,同時探究敲低PC12細胞內(nèi)的Prdx2對于亞鐵離子導(dǎo)致的OS、炎癥反應(yīng)、細胞損傷和凋亡的影響。方法:1.檢測FS對PC12細胞內(nèi)Prdx2表達的影響:使用免疫熒光和Western Blot檢測PC12細胞內(nèi)Prdx2蛋白的表達,使用qRT-PCR檢測PC12細胞內(nèi)Prdx2 mRNA的水平。2.穩(wěn)定表達Prdx2 shRNA的PC12細胞株的建立:向PC12細胞轉(zhuǎn)染表達綠色熒光蛋白(Green Fluorescence Protein,GFP)和 Prdx2 shRNA 或 Ctrl shRNA 的慢病毒,轉(zhuǎn)染24h后,將細胞稀釋10倍,進行傳代,待細胞貼壁后,使用1μ g/mL的嘌呤霉素進行篩選,一周后即可得到Prdx2 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)株,觀察穩(wěn)轉(zhuǎn)株中GFP的表達,并應(yīng)用qRT-PCR和Western Blot分別檢測Prdx2 mRNA和蛋白的水平。3.細胞實驗分組:將細胞實驗分為4組,即Ctr1組,FS刺激組(10 μ mol/L FS刺激 PC12 細胞 24h),FS+Prdx2c 組(10μmol/L FS 刺激穩(wěn)定表達 Ctrl shRNA的 PC12 細胞 24h),FS+Prdx2i 組(10μmol/L FS 刺激穩(wěn)定表達 Prdx2 shRNA的PC12細胞24h)。4.細胞內(nèi)亞鐵離子濃度的檢測:我們使用菲洛嗪法檢測各組細胞內(nèi)亞鐵離子的濃度,以此來明確敲低Prdx2是否會影響FS刺激的PC12細胞內(nèi)的亞鐵離子含量。5.細胞損傷和凋亡的檢測:分別用LDH釋放實驗和流式凋亡檢測來衡量PC12細胞損傷和凋亡的情況。6.凋亡相關(guān)蛋白的檢測:使用Western Blot檢測PC12細胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Cytochrome C 和 Cleaved Caspase-3 的表達。7.OS相關(guān)指標的檢測:使用免疫熒光檢測3'-Nitrotyrosine來衡量蛋白質(zhì)氧化的程度;測量細胞內(nèi)MDA的含量來評估脂質(zhì)氧化的程度;使用Western Blot檢測γ-Histone H2A.X的表達來衡量DNA氧化損傷的程度。8.炎癥反應(yīng)相關(guān)指標的檢測:使用Western Blot檢測細胞核中NF-κ B p65的含量,以及總蛋白中COX-2的水平;使用ELISA檢測細胞上清中TNF-a和IL-1 β的含量。結(jié)果:1.FS可促進PC12細胞中Prdx2的轉(zhuǎn)錄和表達:FS刺激后,PC12細胞中Prdx2 mRNA和蛋白的水平明顯升高。2.在穩(wěn)定表達Prdx2 shRNA的PC12細胞中,Prdx2的轉(zhuǎn)錄和表達受到顯著的抑制:在穩(wěn)轉(zhuǎn)株中,幾乎所有的細胞均表達GFP,并且Prdx2mRNA和蛋白的水平明顯降低。3.敲低Prdx2不會影響FS刺激的PC12細胞內(nèi)的亞鐵離子濃度:菲洛嗪法顯示FS刺激可顯著升高PC12細胞內(nèi)的亞鐵離子濃度,而敲低Prdx2對FS的這一作用無明顯影響。4.敲低PC12細胞中的Prdx2可加重FS導(dǎo)致細胞損傷和凋亡:敲低Prdx2可進一步促進FS導(dǎo)致的LDH釋放;流式凋亡檢測顯示FS可將PC12細胞的凋亡率由0.81%升至11.68%,而敲低Prdx2可將凋亡率進一步上升至19.21%。5.敲低PC12細胞中的Prdx2可進一步促進FS導(dǎo)致的凋亡相關(guān)蛋白的表達升高:FS 可升高 Bax/Bcl-2 表達比,以及 Cytochrome C 和 Cleaved Caspase-3 的表達,敲低Prdx2可進一步促進上述現(xiàn)象。6.敲低PC12細胞中的Prdx2可加重FS導(dǎo)致的OS:FS刺激后,PC12細胞中3'-Nitrotyrosine、MDA和γ-HistoneH2A.X的含量明顯升高,表明FS可導(dǎo)致PC12細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化和DNA氧化損傷;而敲低Prdx2可進一步促進這三者的升高。7.敲低PC12細胞中的Prdx2可加重FS導(dǎo)致的炎癥反應(yīng):敲低Prdx2進一步促進FS導(dǎo)致的NF-κ B p65核轉(zhuǎn)位以及COX-2、TNF-a和IL-1 β的表達升高。結(jié)論:1.亞鐵離子可促進PC12細胞中Prdx2的轉(zhuǎn)錄和表達。2.敲低PC12細胞中的Prdx2可通過加劇OS和炎癥反應(yīng)進一步加重亞鐵離子導(dǎo)致的細胞損傷與凋亡,表明Prdx2在抵御亞鐵離子導(dǎo)致的神經(jīng)損傷的過程中具有重要作用。
【圖文】：

圖１．邋ＦＳ作用濃度與作用時間的確定。逡逑（Ａ）邋ＰＣ１２邋細胞經(jīng)不同濃度（ｌｕｍｏｌ／Ｌ、２ｙｍｏｌ／Ｌ、５ｕｍｏｌ／Ｌ、ｌ0ｙｍｏｌ／Ｌ、逡逑２０邋ｕ邋ｍｏｌ／Ｌ）的ＦＳ處理２４ｈ后，使用ＣＣＫ－８檢測細胞活力。（Ｂ）使用１０邋ｙ邋ｍｏｌ／Ｌ逡逑－

§逡逑ｉ邋Ｔ邋Ｘ邋＊邐｜１００，ｓ＾ｊ邋，，逡逑１邐ｉｆ邐１５０１邐Ｉ邐？邐ｉ逡逑＾Ｐ—ｆ邋■＇邐■嘴邋■邐０４邋Ｔ邋Ｉ－邋－Ｉ邐邐＾邐＾邐＾邐＾邐＾邋＾邋＜ｗ邐＾ＦＳ邋（Ｍｍｏｌ／Ｌ）邐Ｔｉｍｅ邋（ｈ）逡逑作用濃度與作用時間的確定。逡逑１２邋細胞經(jīng)不同濃度（ｌｕｍｏｌ／Ｌ、２ｙｍｏｌ／Ｌ、５ｕｍｏｌ／Ｌ、ｌ0ｙｍｏ／Ｌ）的ＦＳ處理２４ｈ后，使用ＣＣＫ－８檢測細胞活力。（Ｂ）使用１ＰＣ１２細胞，然后在不同時間點（３ｈ、６ｈ、１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ）使活力。（＊Ｐ〈0．0５，ＷＰ＜０．邋０１邋ｖｓ．邋Ｃｔｒｌ）逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R741

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3 尹子洋;化學(xué)混凝—亞鐵與次氯酸鈉處理石化廢水實驗研究[D];廣東工業(yè)大學(xué);2014年

4 劉志娟;摻鐵硅溶膠的制備及其對真絲的整理[D];蘇州大學(xué);2013年

5 盛杰;鋼渣（鐵氧化物）/亞鐵離子還原硝基苯研究[D];同濟大學(xué);2007年

6 王芳;配聚污水中亞鐵離子和硫化物去除效果及降粘機理研究[D];山東大學(xué);2016年

7 于法標;用于細胞內(nèi)具有重要生物學(xué)意義的活性小分子物種的高選擇性識別的新型熒光探針的合成研究及其在生物體系中的應(yīng)用[D];山東師范大學(xué);2009年

8 劉晗;炭基納米零價鐵/二價鐵協(xié)助自由基去除全氟化合物效能及機制[D];西南科技大學(xué);2017年

9 祝巨;甘氨酸與亞鐵離子間的配位反應(yīng)研究[D];浙江大學(xué);2010年

10 謝曉芳;基于過硫酸鹽活化硫酸自由基高級氧化技術(shù)降解廢水中苯胺的研究[D];華南理工大學(xué);2012年

本文編號：2621963