發(fā)布時間：2020-04-07 13:58

【摘要】：目的:研究SERCA2(ATP2a2)基因及蛋白在難治性癲癇細(xì)胞模型中的表達(dá),天麻素干預(yù)對難治性癲癇神經(jīng)元SERCA2(ATP2a2)表達(dá)的影響,進(jìn)一步探討天麻素抗癲癇的機(jī)制。方法:新生乳鼠,75%酒精消毒后迅速斷頭取腦,分離出雙側(cè)海馬,以神經(jīng)元專用無血清培養(yǎng)基(neurobasal plus media)和B 27補(bǔ)充劑等體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元;第5天用抗NeuN免疫熒光法鑒定神經(jīng)元并計算純度;第7天,將培養(yǎng)的神經(jīng)元隨機(jī)分組為正常對照組(C)、模型組(M)、模型+1μM天麻素組(G1)、模型+10μM天麻素組(G2)、模型+100μM天麻素組(G3),模型+1 mM天麻素組(G4),倒置相差顯微鏡觀察各組神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化。實(shí)時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測ATP2a2(SERCA2)mRNA的表達(dá),Western blot技術(shù)檢測ATP2a2蛋白及c-PARP蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果:(1)難治性癲癇細(xì)胞模型出現(xiàn)神經(jīng)元融合、死亡。(2)在模型組,凋亡指標(biāo)c-PARP蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(P0.01),天麻素可以降低凋亡指標(biāo)c-PARP的表達(dá)(P0.05)。(3)相比于對照組,模型組ATP2a2(SERCA2)mRNA出現(xiàn)表達(dá)量降低(P0.05);100μM天麻素能顯著上調(diào)ATP2a2(SERCA2)mRNA的表達(dá)(P0.05)。(4)ATP2a2蛋白主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表達(dá),平均灰度值:正常對照組(1.0039±0.0027),模型組(0.4371359±0.1522186),模型+100μM天麻素組(0.9770±0.0323),正常對照組和模型組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),模型組和模型+100μM天麻素組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.難治性癲癇模型存在SERCA2(ATP2a2)基因及蛋白表達(dá)下調(diào)及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)變化。2.難治性癲癇細(xì)胞模型中存在神經(jīng)元的損傷、凋亡。3.天麻素可以上調(diào)難治性癲癇細(xì)胞模型SERCA2(ATP2a2)基因及蛋白的表達(dá)。4.天麻素可以緩解難治性癲癇細(xì)胞模型的凋亡。5.天麻素可通過上調(diào)SERCA2(ATP2a2)表達(dá)來緩解難治性癲癇細(xì)胞模型的凋亡。
【圖文】：

第 2 章 結(jié)果第 2 章 結(jié)果2.1 倒置相差顯微鏡下體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)觀察剛分離種植的海馬神經(jīng)元為圓形，透亮，無突起，呈單細(xì)胞懸浮狀態(tài)（Figure1（a））；4-6 h 后，絕大部分海馬神經(jīng)元可以良好貼壁，少數(shù)神經(jīng)元可有 1-2 個小突起長出。種植 6-10 h后 Plating media 全部換液為 Culture media。培養(yǎng)第 3 天，貼壁的海馬神經(jīng)元伸長出粗細(xì)不均的數(shù)個突起，胞體透亮，呈梭形、三角形等，相鄰的神經(jīng)元之間可有稀疏網(wǎng)絡(luò)連接（Figure 1（b））。培養(yǎng)至第 5 天的海馬神經(jīng)元，生長狀態(tài)良好，立體感和折光性明顯，胞體增大，突起延長交織成網(wǎng)（Figure 1（c））。培養(yǎng)第 7 天的海馬神經(jīng)元，胞體增大飽滿，有明顯的光暈；神經(jīng)元突起變多，軸突細(xì)長，神經(jīng)元之間突起相互交織，形成稠密復(fù)雜但分布均勻的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Figure 1（d））。

第 2 章 結(jié)果NeuN 蛋白存在于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的大多數(shù)神經(jīng)元的細(xì)胞核和質(zhì)中，存在 46kDa 和 48 kDa 兩個亞型[40]；除少數(shù)類型神經(jīng)元（如小腦、視網(wǎng)膜感光細(xì)胞和 γ-運(yùn)動神經(jīng)元等）外，絕大多數(shù)神經(jīng)元是強(qiáng) NeuN 陽該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)仍然未知，蛋白質(zhì)的功能也仍然不完全清楚，但 Anti-Neu個可靠的標(biāo)記分裂后神經(jīng)元的抗體，在識別組織培養(yǎng)和切片的神經(jīng)元、測域的神經(jīng)和膠質(zhì)細(xì)胞比、研究神經(jīng)元分化和評估神經(jīng)元狀態(tài)等方面，已經(jīng)用了 20 年[41]。免疫熒光結(jié)果顯示，明場視野下，細(xì)胞狀態(tài)良好（Figure 2（共聚焦顯微鏡下，海馬神經(jīng)元胞體及胞質(zhì)可采集到明顯熒光信號（Figure 性對照組未見熒光。通過計算海馬神經(jīng)元純度，，培養(yǎng)至第 5 天的海馬神超過 92%，說明本實(shí)驗(yàn)中方法所培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元純度足夠高，可以用治性癲癇細(xì)胞模型及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.2 海馬神經(jīng)元的鑒定及純度計算結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：長江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R742.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 李飛;成祥林;;天麻素對癲疒間大鼠海馬氧化應(yīng)激水平的影響[J];實(shí)用藥物與臨床;2015年06期

2 李飛;孫亞凌;成祥林;蔡光欣;蔡新宇;徐曉明;朱占勝;;天麻素調(diào)節(jié)癲疒間大鼠海馬炎癥信號通路的抗癲疒間機(jī)制研究[J];實(shí)用藥物與臨床;2015年05期

本文編號：2617994