【摘要】：缺血性腦中風(fēng)能夠誘導(dǎo)快速的血腦屏障破壞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活,然而血腦屏障滲漏和激活的小膠質(zhì)細(xì)胞如何影響中風(fēng)后神經(jīng)元的恢復(fù)以及樹(shù)突棘的可塑性還不清楚。近幾年來(lái),雙光子活體成像技術(shù)的出現(xiàn)使得在活體腦內(nèi)觀(guān)察突觸結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化成為可能,本研究利用這一技術(shù)結(jié)合轉(zhuǎn)基因熒光小鼠研究了腦中風(fēng)后血腦屏障滲漏和小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)可塑性的影響。本論文首先利用神經(jīng)元有熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因小鼠和雙光子活體成像技術(shù)研究了缺血再灌注后血腦屏障滲漏對(duì)樹(shù)突損傷以及樹(shù)突棘可塑性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在正常小鼠中,盡管甘露醇誘導(dǎo)的血腦屏障的滲漏沒(méi)有引起炎癥反應(yīng),也沒(méi)有影響樹(shù)突棘的更新率,但卻觸發(fā)了小膠質(zhì)細(xì)胞突起的去分支化;而在腦缺血再灌注后,血腦屏障滲漏的增加加速了小膠質(zhì)細(xì)胞突起的去分支化,同時(shí)也增加了炎癥反應(yīng);更為重要的是,盡管血腦屏障滲漏的增加沒(méi)有顯著地影響神經(jīng)元損傷程度,也沒(méi)有影響樹(shù)突結(jié)構(gòu)的可逆性恢復(fù),但血腦屏障滲漏的增加影響了樹(shù)突棘的可塑性,和中風(fēng)-對(duì)照組相比,血腦屏障滲漏增加后,樹(shù)突棘新生率下降,消失率上升,導(dǎo)致了樹(shù)突棘的凈丟失。在腦缺血再灌注后,小膠質(zhì)細(xì)胞被快速激活,但在不同缺血條件下小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化以及增殖規(guī)律仍不清楚。在本研究中,我們利用雙光子活體成像、共聚焦成像和高通量測(cè)序技術(shù)研究了不同程度的缺血對(duì)小膠質(zhì)形態(tài)變化以及增殖反應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在缺血再灌流期間,小膠質(zhì)細(xì)胞被迅速激活,其突起快速的去分支化,但其突起的恢復(fù)以及增殖反應(yīng)與缺血程度有關(guān)。在短暫性缺血模型中,其突起能夠在1天后恢復(fù)正常的水平,也沒(méi)有明顯的增殖反應(yīng),然而,在延長(zhǎng)中風(fēng)時(shí)間至1小時(shí)后,小膠質(zhì)細(xì)胞突起在再灌流2天后依然處于去分支化狀態(tài),而且小膠質(zhì)細(xì)胞有明顯的增殖反應(yīng)。另外,在長(zhǎng)時(shí)間中風(fēng)模型中,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)大量與小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的炎癥因子顯著高調(diào),同時(shí)CSF1R信號(hào)通路也被激活。通過(guò)GW2580抑制CSF1R信號(hào)通路或LPS高調(diào)炎癥水平發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖受CSF1R信號(hào)通路以及炎癥反應(yīng)的調(diào)控。小膠質(zhì)細(xì)胞不僅參與神經(jīng)元的發(fā)育,而且參與了樹(shù)突棘的修剪。近年來(lái),CX3CR1~(CreER/+):R26~(iDTR/+)轉(zhuǎn)基因小鼠的出現(xiàn)使得在活體腦內(nèi)高效且特異性地消除小膠質(zhì)細(xì)胞成為可能。本研究利用CX3CR1~(CreER/+):R26~(iDTR/+)轉(zhuǎn)基因小鼠和雙光子活體成像技術(shù)研究了腦中風(fēng)后小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的的影響。結(jié)果表明,在正常小鼠中,特異性消除小膠質(zhì)細(xì)胞降低了樹(shù)突棘新生率,但沒(méi)有影響小鼠的運(yùn)動(dòng)能力,然而在腦缺血再灌注后,特異性消除小膠質(zhì)細(xì)胞顯著地影響樹(shù)突棘的可塑性,導(dǎo)致了樹(shù)突棘新生率下降,消失率進(jìn)一步上升,造成了樹(shù)突棘的凈丟失,并導(dǎo)致了小鼠運(yùn)動(dòng)能力的顯著下降,此外,腦缺血再灌注后特異性消除小膠質(zhì)細(xì)胞也改變了炎癥因子和突觸分子mRNA的表達(dá)水平。這些研究結(jié)果表明,腦缺血再灌注后,大腦神經(jīng)元的樹(shù)突棘在缺血后具有一定的可塑性,增加血腦屏障的滲漏會(huì)改變樹(shù)突棘的可塑性,最終導(dǎo)致了樹(shù)突棘的過(guò)量丟失。另外,短時(shí)間的腦缺血再灌注不會(huì)引起小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖,但1小時(shí)的腦缺血促進(jìn)了小膠質(zhì)細(xì)胞的去分支化和炎癥反應(yīng),同時(shí)也導(dǎo)致了由CSF1R信號(hào)通路介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞增殖反應(yīng);進(jìn)一步特異性消除小膠質(zhì)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),在腦缺血再灌注后小膠質(zhì)細(xì)胞的存在能夠阻止樹(shù)突棘的丟失和運(yùn)動(dòng)功能的障礙,有利于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重建和運(yùn)動(dòng)能力的恢復(fù)。綜上所述,血腦屏障滲漏這一潛在的風(fēng)險(xiǎn)和小膠質(zhì)細(xì)胞這一有利的作用為腦中風(fēng)的臨床治療提供了一定的參考依據(jù)。
【圖文】：

23圖 3-1. 短暫性全腦缺血模型的建立A. 小鼠頸總動(dòng)脈結(jié)扎或松開(kāi)來(lái)控制中風(fēng)程度以及再灌流時(shí)間。B. 雙光子活體測(cè)定全腦缺血模型中血流速度。BCAL 30 min 后血流速度迅速降低，而再灌流 180 min 后血流速度可恢復(fù)至正常水平。C. 血流速度統(tǒng)計(jì)結(jié)果。BCAL 30 min 后血流速度幾乎為 0，再灌流 180min 后血流速度恢復(fù)至正常水平。D. 全腦缺血過(guò)程中神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的活體雙光子成像。BCAL 之后神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷，樹(shù)突結(jié)構(gòu)呈念珠狀，再灌流 180 min 后樹(shù)突結(jié)構(gòu)恢復(fù)。E. 短暫性缺血后血腦屏障的活體雙光子成像。尾靜脈注射 EB 后顯示活體內(nèi)血管完整性，在BCAL 30 min 后發(fā)現(xiàn)血腦屏障滲漏，而再灌流 180 min 后血腦屏障恢復(fù)。Fig. 3-1 Establishment of the transient global cerebral ischemic model.The mice were subjected to transient ischemia by tightening the surgical sutures. A. After bilateralcommon carotid arteries occlusion, surgical sutures were untied to reperfusion the blood vessels.B. Two-photo line scanning imaging of the blood flow velocity before ischemia, 30 min afterischemia and 180 min after reperfusion. C. Quantification of blood flow velocity. D.Morphological changes in dendritic structures before ischemia, 30 min after ischemia, and 180

26圖 3-2. 全腦缺血模型中甘露醇對(duì)血腦屏障滲漏性的影響A. 缺血再灌注過(guò)程中雙光子活體成像時(shí)間軸。箭頭指示成像時(shí)間點(diǎn)。B. 血管溢出物和樹(shù)突結(jié)構(gòu)的雙光子成像。實(shí)驗(yàn)分為四組：Sham-control 組、Sham-mannitol 組、BCAL-control組、BCAL-mannitol 組，，成像時(shí)間分為：Pre、2 min、60 min、180 min。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甘露
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R743.3

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