【摘要】：研究背景和目的神經(jīng)病理性痛是最常見的慢性痛之一,主要由神經(jīng)損傷或炎癥引起,其顯著特點為損傷愈合后疼痛癥狀依然存在,且痛感強烈、頑固,給患者造成了極大的痛苦,目前其確切機(jī)制仍不清楚。核蛋白聚ADP-核糖基化(Poly(ADP-ribose)ation,PAR)是聚ADP-核糖聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)激活后,利用尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD~+)提供的ADP-核糖,催化其與相關(guān)核蛋白結(jié)合,形成多聚ADP-核糖基化核蛋白,也被認(rèn)為是表觀遺傳學(xué)的一種形式。研究發(fā)現(xiàn)PARP-1激活通過促進(jìn)炎癥相關(guān)的基因表達(dá)在炎性疾病的發(fā)生過程發(fā)揮重要作用。最近研究證明PARP-1催化的核蛋白聚ADP-核糖化通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄參與腦學(xué)習(xí)與記憶的長時程突觸可塑性。周圍神經(jīng)損傷或炎癥誘導(dǎo)的脊髓水平突觸傳遞的可塑性,被認(rèn)為是病理性痛形成和維持過程中樞敏感化的基礎(chǔ),但迄今PARP-1在神經(jīng)病理性痛中的作用及機(jī)制仍無系統(tǒng)的研究和報道。本實驗采用大鼠腰5脊神經(jīng)結(jié)扎(Lumbar 5 Spinal Nerve Ligation,L5 SNL)疼痛模型,結(jié)合痛行為學(xué)實驗和Western blot、RT-PCR和qPCR等分子生物學(xué)技術(shù),觀察核酶PARP-1在L5 SNL引起神經(jīng)病理性痛中的作用以及PARP-1激活調(diào)控神經(jīng)病理性痛的機(jī)制。其結(jié)果將為進(jìn)一步闡明神經(jīng)病理性痛的機(jī)制提供新的理論上的依據(jù),同時也可能為臨床病理性痛的防治提供新的藥物作用靶點。研究結(jié)果1.大鼠L5 SNL后PARP-1及其催化產(chǎn)物PAR、以及致炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α在DRG和脊髓中的表達(dá)變化(1)L5 SNL模型的建立將實驗用雄性SD大鼠隨機(jī)分為實驗組(L5 SNL組,n=10)和對照組(sham組,n=8),參照文獻(xiàn)報道的方法進(jìn)行L5 SNL手術(shù),測試術(shù)前3、1天和術(shù)后1、3、5、7、10、14、21、28天的機(jī)械刺激撤足閾值(Paw withdrawal threshold,PWT)和熱刺激撤足潛伏期(Paw withdrawal latency,PWL),發(fā)現(xiàn)從術(shù)后1天開始大鼠術(shù)側(cè)后肢PWT和PWL開始顯著下降(與sham組相比較,***P0.001,**P0.01),并且在術(shù)后第7天達(dá)到最低(與sham組相比較,***P0.001,***P0.001),而對側(cè)無明顯變化。(2)L5 SNL后大鼠DRG和脊髓背角PARP-1、PAR及致炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)變化取術(shù)后0、1、3、7、10、14天大鼠術(shù)側(cè)L4-5 DRG和L4-5脊髓進(jìn)行RT-PCR和qPCR檢測PARP-1 mRNA含量的變化,取對側(cè)L4-5DRG和L4-5脊髓進(jìn)行qPCR檢測PARP-1 mRNA含量的變化,取術(shù)側(cè)L4-5 DRG和L4-5脊髓進(jìn)行Western blot檢測PARP-1及其下游產(chǎn)物PAR以及致炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α表達(dá)量變化。RT-PCT和qPCR結(jié)果顯示L5 SNL可以引起術(shù)側(cè)L4-5 DRG和L4-5脊髓PARP-1 mRNA含量升高,并在術(shù)后第7天或第10天達(dá)到最高(與對照組相比,*P0.05,**P0.01,***P0.001,n=3),而對側(cè)qPCR結(jié)果顯示PARP-1 mRNA含量無明顯變化。Western blot結(jié)果顯示,L5 SNL后PARP-1及催化產(chǎn)物PAR以及致炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)量維持在較高水平,并且在第7天表達(dá)量最高(與對照組相比,*P0.05,**P0.01,***P0.001,n=3)。以上結(jié)果表明L5 SNL可引起大鼠術(shù)側(cè)L4-5DRG和L4-5脊髓中PARP-1及其催化產(chǎn)物PAR、以及致炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α表達(dá)上調(diào)。2.大鼠L5 SNL后PARP-1在DRG和脊髓背角表達(dá)的細(xì)胞類型利用免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)對L5 SNL和正常大鼠的L4-5 DRG和脊髓進(jìn)行染色拍照觀察,發(fā)現(xiàn)L5 SNL可以引起PARP-1在DRG和脊髓背角表達(dá)升高。進(jìn)一步采用免疫熒光雙染色技術(shù)對PARP-1在DRG和脊髓中表達(dá)的細(xì)胞類型進(jìn)行了觀察,結(jié)果顯示,PARP-1與DRG中的大中型神經(jīng)元細(xì)胞和小型神經(jīng)元細(xì)胞有共定位,與脊髓中的神經(jīng)元細(xì)胞和衛(wèi)星樣膠質(zhì)細(xì)胞有共定位。3.鞘內(nèi)注射PARP-1抑制劑Tiq-A能夠部分抑制L5 SNL引起的神經(jīng)病理性痛,同時也可以下調(diào)PAR以及致炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)。大鼠L5 SNL后立即鞘內(nèi)注射PARP-1抑制劑Tiq-A(5、25、50μg/10μl),而后每天1次,連續(xù)5天,同時觀察大鼠的痛行為學(xué)變化。結(jié)果顯示,與溶劑組(i.t.10μL 10%DMSO生理鹽水)相比較,鞘內(nèi)注射Tiq-A組大鼠術(shù)側(cè)后肢PWT和PWL呈劑量依賴性升高(1 d,P0.001;3 d,P0.001;5 d,P0.001;7 d,P0.001;10 d,P0.001;14 d,P0.001,n=8)。Western blot結(jié)果顯示,與L5 SNL+Vehicle組相比,高劑量組(i.t.50μg/10μl)術(shù)后第7天大鼠術(shù)側(cè)L4-5 DRG和L4-5脊髓中PAR和致炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)量降低(*P0.05,**P0.01,***P0.001,n=3)。這表明了抑制PARP-1的活性可以部分抑制神經(jīng)病理性痛的產(chǎn)生,同時也可以抑制L5 SNL引起的大鼠術(shù)側(cè)L4-5 DRG和L4-5脊髓中PAR、IL-1β、TNF-α表達(dá)上調(diào)的情況。4.神經(jīng)病理性痛形成后,鞘內(nèi)注射PARP-1抑制劑Tiq-A能夠部分逆轉(zhuǎn)神經(jīng)病理性痛的癥狀。L5 SNL后第7天開始,對大鼠進(jìn)行鞘內(nèi)注射Tiq-A 50μg/10μl每只每天,連續(xù)注射4天,觀察大鼠術(shù)側(cè)后肢PWT和PWL。結(jié)果發(fā)現(xiàn)從注射藥物后開始,大鼠術(shù)側(cè)后肢的PWT和PWL開始出現(xiàn)明顯升高,并且在停藥后一直持續(xù)到術(shù)后第14天(7 d,P0.001;10 d,P0.001;14 d,P0.001,n=7)。說明在神經(jīng)病理性痛建立之后,抑制PARP-1的活性可以部分逆轉(zhuǎn)由L5 SNL引起的神經(jīng)病理性痛。5.鞘內(nèi)注射PARP-1 siRNA可以部分抑制神經(jīng)病理性痛的形成。將實驗大鼠隨機(jī)分為sham+轉(zhuǎn)染試劑(Transfection Regant,TR)組、L5 SNL+PARP-1 siRNA組、L5 SNL+Scramble siRNA組、L5 SNL+TR組,每組8只,術(shù)后立即注射藥物,siRNA組每天每只1 nmol siRNA,轉(zhuǎn)染試劑組每天每只10μl轉(zhuǎn)染試劑,連續(xù)注射5天,同時觀察大鼠痛行為學(xué)變化。結(jié)果顯示,鞘內(nèi)注射PARP-1 siRNA組與L5 SNL+TR組相比,大鼠術(shù)側(cè)后肢PWT在術(shù)后3天開始出現(xiàn)明顯升高(***P0.001)并一直持續(xù)到術(shù)后第7天(***P0.001)。而術(shù)側(cè)后肢的PWL在術(shù)后1天即出現(xiàn)顯著升高(**P0.01),同樣一直持續(xù)到術(shù)后第7天(***P0.001)。Scramble siRNA組與L5 SNL+TR組相比較,沒有統(tǒng)計學(xué)差異。Western blot結(jié)果顯示,鞘內(nèi)注射PAPR-1 siRNA可以使術(shù)側(cè)L4-5 DRG和L4-5脊髓中PARP-1、PAR以及致炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)量降低(與sham+TR組相比較,#P0.05,##P0.01,n=3)。6.運動功能檢測發(fā)現(xiàn)給藥并未對實驗大鼠的運動功能造成影響。連續(xù)給藥后的大鼠在完成機(jī)械刺激撤足閾值和熱刺激撤足潛伏期的測試后,進(jìn)行運動功能檢測。通過放置反射、抓握反射、翻正反射3種測試之后,給藥的大鼠均能保持3種反射的運動功能,沒有運動功能異常的情況出現(xiàn)。結(jié)論:大鼠L5 SNL后DRG和脊髓背角PARP-1的表達(dá)上調(diào)通過調(diào)控IL-1β和TNF-α的表達(dá),參與了神經(jīng)病理性痛的形成和維持。
【圖文】：

果5 SNL 后 PARP-1 及其催化產(chǎn)物 PAR、以TNF-α 在 DRG 和脊髓中的表達(dá)變化考 Kim 等人報道的方法[34]，建立模型，并且在術(shù) 和 PWL 作為基礎(chǔ)值，測試術(shù)后 1、3、5、7、10L 并記錄，發(fā)現(xiàn)在術(shù)后 1 天大鼠術(shù)側(cè)后肢的 PWT（著下降（與 sham 組相比較，*** P ＜ 0.001, ** P在術(shù)后 7 天達(dá)到最低（與 sham 組相比較，*** P ayANOVA），與文獻(xiàn)報道一致，模型建立成功。

結(jié)扎（L5 SNL）引起大鼠熱痛覺過敏。行為學(xué)結(jié)果顯示假手術(shù)側(cè)相比，熱刺激撤足潛伏期明顯縮短（與 sham 組1，2-way ANOVA）。術(shù)后 0、1、3、7、10、14 天的大鼠取材進(jìn)行 RT-PCR化，發(fā)現(xiàn) L5 SNL 可以導(dǎo)致術(shù)側(cè) PARP-1 mRNA 在3.4）中含量升高，并且在術(shù)后第 7 天達(dá)到峰值（與* P ＜ 0.001, 1-way ANOVA）。PCR 結(jié)果顯示，，在 L5 SNL 后 PARP-1 mRNA 在術(shù)（圖 3.6A）中含量升高，并且在術(shù)后第 7 天達(dá) ＜ 0.001 , 1-wayANOVA），而在對側(cè) DRG（3.5B-1 mRNA 無明顯變化。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R741

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本文編號：2611308